Expressão e caracterização de uma lectina recombinante de interesse biomédico

Abstract

As lectinas como grupo proteico constituem famílias diversificadas com propriedades distintas. Estão amplamente distribuídas na natureza podendo ser encontradas nos mais variados organismos vivos desde bactérias, fungos, plantas, animais e até humanos, atuando como mediadores de processos biomoleculares. A frutalina é uma lectina de origem em plantas e da família das jacalinas. Isolada das sementes de fruta-pão, Artocarpus incisa ou Artocarpus altilis, uma glicoproteína homotetramérica e que reconhece especificamente resíduos de α-Dgalactose. As lectinas destacam-se de outras proteínas pela sua atividade de ligação específica a recetores glicoconjugados o que permite atuarem como mediadoras de processos biológicos com extrema importância para a biomedicina. Estudos anteriores mostram que a frutalina expressa em P. pastoris tem atividade apoptótica em células tumorais humanas. Ainda muito há por descobrir relativamente ao seu potencial no entanto, aos dias de hoje, é já possível fazer uma avaliação e retirar conclusões do importante papel que a frutalina pode ter na biomédica. Este estudo tem por objetivo a clonagem e expressão de frutalina recombinante em E. coli contendo, em vez do linker nativo, um local para clivagem por ação de uma protease para posterior separação das cadeias β e α como forma de avaliar o impacto da clivagem nas propriedades e atividade da isoforma clonada em E. coli, com a finalidade de caracterização das versões de frutalina recombinante obtidas. A fase de caracterização torna-se importante na medida em que permite avaliar e relacionar a isoforma de frutalina analisada e a influência do processo de clivagem das cadeias na forma e atividade adquirida. Este trabalho envolveu diferentes fases desde a construção genética das sequências de interesse por processos de reação em cadeia da polimerase e a sua transformação em vetores de clonagem apropriados à produção e expressão em sistema E. coli para posterior purificação com recurso a cromatografia de afinidade com iões metálicos imobilizados (IMAC) até à caracterização estrutural das proteínas com recurso a técnicas de dispersão de luz dinâmica (Dynamic Light Scattering) e de cromatografia rápida líquida de proteínas (Fast Protein Liquid Chromatography) A frutalina é estruturalmente constituída por duas cadeias, β e α, ligadas entre si por um linker tetrapeptídico. Este trabalho prendeu-se com a construção de formas recombinantes que diferem na disposição das cadeias β e α em relação à região ligante. Esta região foi também sujeita a alterações, sendo substituída por uma outra zona de reconhecimento para uma protease tobacco etch virus (TEV protease) que possibilite a sua clivagem. Este processo tem por objectivo avaliar a influência da clivagem e posterior refolding na atividade proteica da frutalina. Desta forma projetaram-se duas estratégias, uma estratégia FTL1 com uma construção β+TEV+α e paralelamente uma estratégia FTL2 com uma construção α+TEV+β. Para cada construção foram usados vetores de expressão distintos, pETM-10 e pETM-20, selecionados pelas suas propriedade. Ambos possuem um tag de fusão (His-tag) muito comummente utilizado em estratégias de purificação pela já referida técnica de IMAC e com afinidade aos iões metálicos de níquel. O vetor pETM-20 apresenta ainda uma outra particularidade, um parceiro de fusão Trx descrito como potenciador da expressão, solubilidade e estabilidade proteica. Alterações genéticas à sequência da frutalina foram observadas. Para ambas as estratégias verificou-se o sucesso dos processos de PCR e que se traduziram na correta inclusão do local de clivagem TEV bem como, para a estratégia FTL2, a alteração da disposição das cadeias β e α relativamente à região ligante. Comprovou-se a correta clonagem nos vetores finais de expressão pETM-10 e pETM-20 que foram devidamente transformados na estirpe de E. coli Rosetta, observando-se bons níveis de expressão solúvel de His6-FTL e Trx-His6-TEV-FTL. Obtiveram-se ainda bons níveis de purificação, nomeadamente para His6-FTL2 e Trx-His6-TEVFTL 2. Para remoção dos tags associados e separação das cadeias utilizou-se, para Trx-His6-TEVFTL 2, a TEV protease como agente digestivo. A clivagem ocorreu naturalmente in vitro, verificando-se bons resultados nomeadamente na clivagem da região Trx-His6-TEV. Para recuperação da proteína de interesse recorreu-se à técnica de purificação reversa, procedimento este que mostrou ser eficaz e que permitiu obter as frações de interesse numa forma pura e limpa como se pôde comprovar, resultados que reforçaram a correta clivagem da região que contém Trx por ação da TEV protease. A respetiva análise estrutural mostrou ser preliminar pelo que existe a necessidade de ser mais explorada. Os valores observados sugerem que a proteína analisada não se encontra na forma estrutural tetramérica mas possivelmente numa estrutura de dímeros. Uma análise mais empírica indica que estes valores podem refletir um mau refolding proteico ou até possíveis erros no processo de clivagem.

Lectins as a protein group establish diversified families with distinct properties. They are commonly distributed in nature and can be found in various living organisms like bacteria, fungi, plants, animals and even humans, acting as mediators of biomolecular processes. The frutalin is a lectin derived from plants and the family of jacalinas. Isolated from breadfruit seeds, Artocarpus incisa or Artocarpus altilis, it is a homotetrameric glycoprotein with specifically recognition of α-Dgalactose residues. The lectins are distinguished of other proteins for its activity of specific linking to the glycoconjugates receptors what allows to act as a mediator of biological processes with extreme importance for the biomedicine. Previous studies had shown the express frutalina in P. pastoris has apoptotic activity in human tumor cells. Still much has to be discovered for their potential however, to the present day, it is possible to evaluate and draw conclusions from the important role that frutalin may have in the biomedical field. This study was primarily engaged with the cloning and production of a recombinant frutalin in E. coli containing, instead of the native linker, a site for cleavage by action of a protease for later separation of β and α chains as a way to evaluate the impact of the cleavage in the activity and properties of the protein isoform cloned in E. coli. This work involved different stages since the genetic construct of the sequences of interest by polymerase chain reaction process and its transformation into a cloning vector suitable for production and expression system in E. coli for further purification using immobilized metal on affinity chromatography. To structural characterization of the proteins was used two different technics, dynamic light scattering techniques and fast protein liquid chromatography. The frutalin is essentially composed of two chains, β and α, linked together by a tetrapeptide linker. This work has been focus on the construction of recombinant forms that differ in the arrangement of the β and α chains relative to the linker region. This region was also subject of changes to be replaced by another recognition site for a tobacco etch virus protease (TEV protease) that allows its cleavage. This strategic process acknowledges the influence of cleavage and subsequent refolding in the protein activity. Thus were designed two strategies, one FTL1 strategy with a β+TEV+ α construction and a parallel strategy, FTL2 with a α+TEV+β construction. For each strategy were used different expression vectors, pETM-10 and pETM-20, selected for its properties. Both have a tag (His-tag) very commonly used in purification strategies cited by IMAC technique and nickel affinity to metal ions. For pETM-20 vector showing a particularity, a Trx fusion partner described as an enhancer of the expression, solubility and protein stability. Genetic alterations to the sequence of frutalin were observed. For both strategies, we saw the success of the PCR processes, which resulted in the correct inclusion of TEV cleavage section and, for FTL2 strategy, the change of the arrangement of β and α chains relative to the binding region. It was verified the correct cloning into the expression vectors pETM-10 and pETM- 20 that have been properly transformed into E. coli strain Rosetta observing good levels of soluble expression of His6-FTL and Trx-His6-TEV-FTL. Moreover, it was obtained good levels of purification, particularly for His6-FTL2 and Trx-His6-TEV-FTL2. To remove the associated tags and the separation of the chains was used, to Trx-His6-TEV-FTL2, the TEV protease as a digestive agent. Cleavage occurred naturally in vitro, verifying good results in particular in the cleavage of Trx-His6-TEV region. For recovery of the protein of interest was used the technique of reverse purification, a procedure which proved to be effective and which led to the fractional interest in a pure and clean way. Results reinforced the correct cleavage of the region containing Trx by action of TEV protease. The respective structural analysis proved to be preliminary so, further investigation is required. The observed values suggest that the protein is not analyzed in a tetrameric structure form but into a dimer structure. A more empirical analysis indicates that these values may reflect a wrong protein refolding or even possible errors in the cleavage process.