Introducing resistance genes against ToMV, TYLCV and TSWV infections in two tomato varieties (Muchamiel and De la Pera)

Abstract

Muchamiel and De la Pera are two tomato traditional varieties very appreciated in Spain due to its organoleptic traits and quality, however these varieties are highly susceptible to several viruses as Tomato mosaic virus (ToMV), Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) and Tomato spotted wilt virus (TSWV) leading to huge production losses. In an attempt to increase plant resistance to these viruses the introduction of the virus resistance genes by introgression was tested by other investigation group but it have can cause negative effects in tomato quality and production. The Golden Braid 2.0 cloning system is a new method strategy, it is a comprehensive technological framework that facilitates the construction of increasingly complex multigene structures at the DNA level. This system consists of a set of four destination plasmids (pDGBs) designed to incorporate multipartite assemblies made of standard DNA parts and to combine them binarily to build increasingly complex multigene constructs, based on the use of type IIS restriction enzymes. The main goal of this work is to produce plasmids with the genes that confer resistance to ToMV, TYLCV and TSWV infections using GoldenBraid 2.0 cloning system and ultimately produce traditional tomato varieties (Muchamiel and De la Pera) with engineered resistance genes as way as to confer disease resistance without the linkage drag effect associated to the classical breeding. For this it was designed and created a plasmid that contains the constructions that will provide resistance to the 3 viruses (pEGB3alpha1: Tnos:NptII:Pnos: PTm-22:Tm-22:TTm-22 : PVAHOX1:Ty- 1:Tnos: P35S:Sw-5:Tnos), allowing “fight” against the 3 virus simultaneously without linkage drag. As complementary work it was also developed plasmids with single or with the 3 viral resistance genes with an “extra”, the herbicide resistant acetolactate synthase (ALS) gene, whose plasmid construction has a mutated ALS gene that confer resistance to ALS-inhibiting herbicides.

Muchamiel and De la Pera são duas variedades de tomate muito apreciadas em Espanha devido às suas caraterísticas organoléticas e de qualidade, contudo estas têm elevados padrões de suscetibilidade a viroses como o vírus do mosaico do tomate (ToMV), o vírus do frisado amarelo do tomate (TYLCV) e o vírus do bronzeado do tomate (TSWV), levando a grandes perdas de produção. De modo a aumentar a resistência a esses vírus foi testada a introdução de genes de resistência a vírus por introgressão por outro grupo de investigação, contudo podem verificar-se muitos efeitos negativos ao nível da qualidade e da produção do tomate. O sistema de clonagem GoldenBraid 2.0 é um novo método caraterizado como sendo uma ferramenta tecnológica que facilita a construção de estruturas complexas de múltiplos genes. Este sistema consiste num conjunto de quatro plasmídeos de destino (pDGBs) desenhados para incorporar assemblagens multipartidas a partir de fragmentos padrão de DNA e combiná-los binariamente para produzir estruturas multigénicas cada vez mais complexas, baseado no uso de enzimas de restrição tipo II. O grande objetivo desta tese é produzir plasmídeos que possuam os genes de resistência a infeções por ToMV, TYLCV e TSWV usando o método de clonagem GoldenBraid e finalmente produzir variedades tradicionais de tomate (Muchamiel e De la Pera) com os genes de resistência de modo a conferir resistências sem o efeito “linkage drag” associado ao melhoramento clássico. Para tal, foi desenhado criado um plasmídeo que contém construções que irão providenciar resistência contra as 3 viroses (pEGB3alpha1: Tnos:NptII:Pnos: PTm-22:Tm-22:TTm-22: PVAHOX1:Ty-1:Tnos: P35S:Sw-5:Tnos), permitindo combater os 3 vírus em simultâneo sem a presença de “linkage drag”. Como trabalho complementar foram também desenvolvidos plasmídeos com um ou com os três genes de resistência a vírus com um “extra”, o gene acetolactato sintase (ALS) resistente a herbicida, cujo plasmídeo possui o gene ALS mutado que confere resistência aos herbicidas inibidores de ALS.