O efeito da insulina na placentação: estudos in vitro com células HTR8-SVneo

Abstract

Uma formação adequada da placenta – placentação – é crucial para o sucesso da gravidez e alterações neste processo têm sido associadas a patologias da gravidez tais como pré-eclâmpsia e restrição do crescimento fetal. A diabetes mellitus (DM) é a doença metabólica mais prevalente nas grávidas e está associada a diversas complicações maternas e fetais, tais como macrossomia e parto prematuro. Pouco se sabe sobre as consequências da DM materna no processo de placentação. Por esse motivo, decidiu-se investigar o efeito da exposição crónica a biomarcadores associados aos dois tipos mais frequentes de DM na gravidez, a DM de tipo 2 e a DM gestacional (insulina, leptina, TNF-α e glicose) na placentação, utilizando uma linha celular de trofoblastos extravilositários humanos de primeiro trimestre (células HTR8/SVneo). A exposição das células HTR8/SVneo durante 24h à insulina (1 nM ou 10 nM) ou TNF-α (10 ng/l ou 100 ng/l) provocou uma diminuição na proliferação celular (avaliada pela incorporação de 3H-timidina). Em contraste, a leptina e glicose não provocaram alterações significativas neste parâmetro. Relativamente à viabilidade celular (avaliada pelo método do MTT), apenas o TNF-α (100 ng/l; 24h) induziu um pequeno aumento neste parâmetro. Investigando mais profundamente o efeito antiproliferativo da insulina, verificamos que a diminuição da proliferação celular induzida pela insulina (10 nM; 48h) foi semelhante em células com 4 e 7 dias de cultura. Curiosamente, verificamos que a insulina pode eventualmente provocar hiperplasia dessas células, uma vez que diminui o índice de mitose celular (tal como determinado com o ensaio de 3H-timidina) ao mesmo tempo que aumenta o conteúdo de proteína de cultura (tal como determinado com o ensaio de SRB). Verificamos também que o efeito antiproliferativo de insulina envolve a ativação das vias intracelulares mTOR, PI3K e p38/MAPK. Por outro lado, a exposição à insulina (10 nM; 48h) não mostrou um efeito significativo nem no índice apoptótico nem na capacidade de migração celular. Finalmente, verificamos que os polifenóis resveratrol (2,5 μM) e quercetina (1 μM), os ácidos gordos polinsaturados EPA e DHA (50 μM), o ácido fólico (1 mM) e a sinvastatina (10 μM) não foram capazes de reverter o efeito antiproliferativo da insulina. Em conclusão, ao demonstrar que a insulina, um biomarcador de diabetes na gravidez, possui um efeito antiproliferativo e hiperplásico em trofoblastos extravilositários humanos de primeiro trimestre, os nossos dados sugerem que a hiperinsulinemia poderá provocar uma alteração no processo de placentação.

An adequate formation of the placenta - placentation - is crucial for a successful pregnancy and changes in this process have been associated with pregnancy disorders such as preeclampsia or intrauterine growth restriction. Diabetes is the most prevalent metabolic disease in pregnant women and is associated with several maternal and fetal complications such as macrosomia, abortion or premature delivery. Little is known about the consequences of maternal diabetes in the placentation process. For this reason, we decided to investigate the effect of chronic exposure to biomarkers of the two most common types of diabetes in pregnancy, type 2 diabetes mellitus and gestational diabetes mellitus (insulin, leptin, TNF-α and glucose) in the placentation process, using a first trimester extravillous human trophoblast cell line (HTR8/SVneo cells). Exposure of HTR8/SVneo cells for 24h to insulin (1 nM or 10 nM) or TNF-α (10 ng/l or 100 ng/l) caused a decrease in cell proliferation (measured by 3H-thymidine incorporation). In contrast, leptin and glucose did not cause significant changes in this parameter. As for cell viability (assessed by the MTT method), only TNF-α (100 ng/mL; 24 h) induced a small increase in this parameter. Further investigation on the antiproliferative effect of the insulin showed that the decrease in cell proliferation induced by insulin (10 nM, 48 h) was similar in 4 and 7 day-old cultures. Interestingly, insulin appears to cause hyperplasia of these cells, since it reduces the cell mitotic index (as determined with the 3H-thymidine assay) while increasing the culture protein content (as determined by the SRB test). In addition, we observed that the antiproliferative effect of insulin involves the activation of mTOR, PI3K and p38/MAPK intracellular pathways. Also, we verified that exposure to insulin (10 nM; 48) showed no significant effect on the apoptotic index and on cell migration capacity. Finally, the polyphenols resveratrol (2.5 mM) and quercetin (1 mM), the polyunsaturated fatty acids EPA and DHA (50 mM), folic acid (1 mM) and sinvastatin (10 uM) were not able to reverse the antiproliferative effect of insulin. In conclusion, by showing that insulin, a biomarker of diabetes in pregnancy, has an antiproliferative and hyperplastic effect on first trimester extravillous human trophoblasts, our data suggest that hyperinsulinemia may cause a change in placentation process.