Evolution of the gene regulatory network controlling flower dorsoventral asymmetry

Abstract

The understanding of the origin and evolution of morphological novelties has been a long-standing challenge in biology. It demands the elucidation of developmental and genetic mechanisms that underlie the establishment of such new structures. In order to advance our understanding of the gene regulatory networks (GRNs) underlying novel developmental traits it is essential to study how GRN are first establish, how they evolve and what morphogenetic processes they control. Using these principles, studying traits that have evolved multiple times independently provides a means to elucidate the evolutionary and developmental processes behind adaptive trait diversification. Floral dorsoventral asymmetry is thought to have evolved many times independently in different angiosperm lineages from radially symmetric ancestors and, thus, it provides a good system to study the evolution of a GRN responsible for the establishment of a novel morphology. The establishment of flower asymmetry depends on the activities of a set of transcription regulators that act on the dorsal or ventral domains of the flower meristem. CYCLOIDEA (CYC), DICHOTOMA (DICH) and RADIALIS (RAD) are expressed in the dorsal domain of floral primordia and promote dorsal petal identity. DIV is expressed all-round the floral primordium, even though it only has a phenotypic effect in more ventral regions where it activates CUPULIFORMIS (CUP) that stimulates the production of auxin at the base of the ventral petal and enhancing its proximo-distal growth. Genetic and molecular studies have revealed that RAD is a direct target of CYC and antagonizes the activity of DIV. This was further explored by using a yeast two-hybrid screening, which led to the identification of two novel related MYB-like proteins DIV-and-RAD-Interacting-Factors (DRIFs) that interact with both RAD and DIV. Therefore, the DRIF proteins might also be involved in the antagonism that RAD has on DIV activity in the establishment of flower asymmetry in Antirrhinum. The aim of this thesis is primarily to understand the molecular and cellular mechanisms by which the transcription factors DIV, RAD and DRIF interact in order to generate an asymmetric pattern of gene activity in the flower meristem. Furthermore, to elucidate how this GRN was first established and evolved, the molecular origin and evolution of the DIV, DRIF and RAD (DDR) regulatory module were investigated. To unravel other morphogenetic mechanisms underlying the development of the complex Antirrhinum flower shape it was analyzed which genes are downstream of the DIV-DRIF complex that drive the development of the ventral petal. Furthermore, the function of the DRIF homologs in Arabidopsis, the AtDRIF genes, was also studied in order to give insights into potential roles of the DRIF family in a species with symmetrical flowers. Our results suggest that in the dorsal region of the Antirrhinum flower meristem the dorsal protein RAD antagonizes the activity of the ventral identity protein DIV in a subcellular competition for a DRIF protein, promoting the establishment of the asymmetric pattern of gene activity in the Antirrhinum flower. Results from the study of the evolution of the DDR transcription module indicate that the MYB domain, through which the DIV, DRIF and RAD proteins interact, had a common evolutionary origin from an older MYB domain. Although the DIV and DRIF protein families have appeared before the evolution of the green algae, interactions between the DIV and DRIF proteins are only detected in the seed plants. Moreover, the RAD-DRIF interaction is first detected in ancient angiosperms, despite of the presence of RAD genes in gymnosperms. In Arabidopsis, a species with symmetrical flowers, we show that the AtDRIF genes have a role in flower induction under long days and regulate hypocotyl elongation and apical hook development. The similarity between the phenotype of the AtDRIFs mutant and the lines overexpressing several RAD homologs in Arabidopsis indicates that the AtRADs might be antagonizing the activity of the AtDRIFs in a mechanism which resembles the molecular interaction between the RAD and DRIF proteins in Antirrhinum. The DIV-DRIF transcription complex has most likely been recruited in Antirrhinum to regulate the shaping of the ventral petal. We show that this function might have been established by recruiting a set of genes, which in Arabidopsis are responsible for modulating the development of primordia outgrowth, to act as spatiotemporal regulators of CUP expression during the development of the flower to shape its complex form. Taken together, this thesis provides a deeper understanding on the molecular mechanisms underlying the establishment and evolution of GRNs responsible for the development of new biological forms and functions.

O estudo da origem e evolução de novas morfologias constitui um constante desafio para a biologia, pois requer o estudo dos mecanismos genéticos e de desenvolvimento que regulam a formação de novas estruturas biológicas. De modo a alargar o conhecimento sobre redes genéticas de regulação (RGR) subjacentes ao aparecimento de novas formas biológicas é essencial perceber como as RGR são estabelecidas, como evoluem e que processos morfogenéticos controlam. Seguindo estes princípios, o estudo de características semelhantes que evoluíram em ocasiões independentes, permite explicar a relação entre o desenvolvimento, a evolução e a diversificação de novas características biológicas. A assimetria floral dorsoventral evoluiu independentemente em diferentes linhagens de angiospérmicas a partir de ancestrais com flores radiais, e por isso, constitui um bom sistema de estudo para melhor compreender as interações moleculares responsáveis pelo estabelecimento de uma nova morfologia. O estabelecimento da assimetria floral depende da atividade de um conjunto de reguladores de transcrição que atuam em regiões dorsais ou ventrais do meristema floral. CYCLOIDEA (CYC), DICHOTOMA (DICH) e RADIALIS (RAD) são expressos no domínio dorsal do primórdio floral e promovem a identidade das pétalas dorsais. DIV é expresso em todo o primórdio floral, apesar de ter atividade fenotípica na região ventral onde ativa CUPULIFORMIS (CUP), que por sua vez, estimula a produção de auxinas na base da pétala ventral, polarizando o tecido e promovendo o seu crescimento proximo-distal. Estudos moleculares e genéticos revelaram que RAD é um alvo direto de CYC e antagoniza a atividade de DIV. A natureza deste antagonismo foi explorada através de um rastreio por yeast two-hybrid que levou à descoberta de duas novas proteínas MYB-like DIV-and-RAD-Interacting-Factors (DRIFs) que interagem tanto com RAD como com DIV. Consequentemente, as proteínas DRIF poderão estar envolvidas no antagonismo que RAD exerce sobre DIV e que é essencial para o estabelecimento da assimetria floral em Antirrhinum. O objetivo desta tese passa por compreender os mecanismos moleculares e celulares que levam a que a interação entre os fatores de transcrição DIV, RAD e DRIF determinem um padrão assimétrico de expressão genética. De modo a perceber como esta RGR se estabeleceu e evoluiu, foi investigada a origem molecular e evolução do módulo de transcrição DIV, DRIF, RAD (DDR). Adicionalmente, para encontrar outros mecanismos morfogenéticos responsáveis pelo desenvolvimento da forma complexa da flor de Antirrhinum, foram analisados os genes a jusante do complexo DIV-DRIF que induz o desenvolvimento da complexa pétala ventral. A função dos homólogos DRIF em Arabidopsis, os genes AtDRIFs, foi também estudada, de modo a perceber qual a putativa função da família DRIF numa espécie com flores simétricas. Os resultados obtidos sugerem que na região dorsal do meristema floral de Antirrhinum a proteína dorsal RAD antagoniza a atividade da proteína ventral DIV através de uma competição subcelular por uma proteína DRIF, promovendo assim o estabelecimento de um padrão assimétrica de atividade genética na flor de Antirrhinum. O estudo da evolução do módulo de transcrição DDR revelou que o domínio MYB, através do qual as proteínas DIV, DRIF e RAD interagem, teve uma origem comum a partir de um domínio MYB ancestral. Apesar das famílias de proteínas DIV e DRIF terem surgido anteriormente à evolução das algas verdes, interações entre estas duas famílias de proteínas são só detetadas em espermatófitas. A interação RAD-DRIF é detetada numa angiospérmica ancestral, embora a família de genes RAD esteja já presente em gimnospérmicas. Em Arabidopsis, uma espécie com flores simétricas, os genes AtDRIF desempenham um papel na indução da floração em dias longos e regulam a elongação do hipocótilo assim como o desenvolvimento do gancho apical do hipocótilo. A similaridade entre o fenótipo de mutantes AtDRIF e o de linhas de sobre-expressão de vários homólogos de RAD em Arabidopsis indica que estes poderão antagonizar a atividade dos AtDRIFs utilizando um mecanismo que se assemelha à interação molecular entre as proteínas DRIFs e RAD em Antirrhinum. O complexo transcricional DIV-DRIF foi provavelmente recrutado em Antirrhinum para regular o desenvolvimento da pétala ventral tendo sido aqui demonstrado que esta função foi presumivelmente estabelecida pelo recrutamento de um conjunto de genes, que em Arabidopsis são responsáveis por modular o desenvolvimento de primórdios de vários orgãos, de modo a atuarem como reguladores espácio-temporais da expressão de CUP durante o desenvolvimento das pétalas de Antirrhinum. Em suma, esta tese contribui com um conhecimento mais profundo sobre os mecanismos moleculares subjacentes ao estabelecimento e evolução de RGRs responsáveis por gerar novas morfologias e funções biológicas.