Synthesis of new peptide derivatives that self-assemble into nanostructured hydrogels for biomedical applications

Abstract

Low molecular weight hydrogelators (LMWHs) are small molecules that selfassemble in water as a result of weak intermolecular forces, and trap water in a three-dimensional structure, thus giving a gel. High water content, biocompatibility and similarity to the extracellular matrix make LMWHs attractive for a wide range of biomedical applications. In recent years, hydrogels of small peptides, especially diand tripeptides, have been developed. These hydrogels are attractive due to their uncomplicated synthetic procedures, chemical variability and potential introduction of biological functionalities. However, the knowledge of the driven forces that govern hydrogelation of small peptides still requires extensive studies. Susceptibility to enzymatic hydrolysis is the main limitation of peptide hydrogels. Replacing natural amino acids by non-proteinogenic analogues is a well established strategy to endow peptides and proteins with proteolytic stability. In this work several dipeptides N-capped with different aromatic moieties, such as naproxen, 2-naphthylacetyl and 1-naphthoyl were synthesized and characterized. All the dipeptides contained one non-proteinogenic dehydroamino acid in the second residue [dehydrophenylalanine ( Phe), dehydroaminobutyric acid ( Abu) or dehydroalanine ( Ala)]. Some of them showed to be biocompatible and resistant to proteases. The dipeptides were tested as hydrogelators, using temperature and pH triggers [addition of hydrochloric acid or D-glucono- -lactone (GdL)]. It was found that only dehydrodipeptides having at least one aromatic amino acid were efficient hydrogelators. Molecular dynamics simulations were used to obtain insights into the underlying molecular mechanism of self-assembly and to rationalize the design of this type of hydrogelators. The results obtained were in excellent agreement with the experimental observations. The characterization of the hydrogels was carried out using transmission electron microscopy (TEM), UV-visible and fluorescence spectroscopies, circular dichroism (CD) and rheology. The dipeptides with N-protecting aromatic moieties organized into high order arrangements in the gel phase. The gels consisted of networks of crosslinked nanofibres with varying widths and densities. Rheology demonstrated that the elasticity and healing properties of the gels were different for each peptide. For the same peptide, the rheological properties depended on factors such as peptide concentration and pH. In this work, the first tryptophan or 1-naphthoyl N-capped dipeptide hydrogelators were described. The latter gave highly elastic hydrogels with low critical gelation concentrations. The hydrogel of naproxen-L-Trp-Z- Phe-OH was used to incorporate non-covalently a potential anti-tumour thieno[3,2-b]pyridine derivative. Fluorescence and FRET measurements indicated that the drug was located in a hydrophobic environment, near or associated with the peptide fibres, demonstrating the possible application of this type of hydrogels as novel drug-nanocarriers. A peptide with a pyridine-2,6-dicarboxamide between two dehydrodipeptides (LPhe- Z- Phe) was also prepared and characterized. The gelation of this peptide was accomplished using a pH trigger. The gels showed characteristics comparable to those of the N-protected dipeptides referred above. The self-assembly of this peptide was also studied in different solvents and in the presence of different metal ions. One of the dipeptide hydrogelators was linked to the bioactive epitope Arg-Gly-Asp (RGD) and its possible application as an extracellular matrix surrogate was tested. The peptide naproxen-L-Ala-Z- Phe-Gly-L-Arg-Gly-L-Asp-Gly-OH gave thermoreversible and self-healing hydrogels at pH 6 and low concentrations. After peptide neutralization, hydrogels were obtained in physiological conditions. Cell toxicity was observed above 0.5 mM, possibly due to the formation of aggregates. A similar peptide having a glutamic acid residue instead of aspartic acid (RGE peptide) was also prepared, and did not showed any toxicity until 1.2 mM, nor aggregate formation. Molecular dynamics simulations showed that the RGD peptide populates only one conformation, while the RGE peptide presents a population with three distinct conformations. Preliminary results obtained in 2D culture of fibroblasts on RGE peptide gels showed cell penetration and adhesion. This result indicates that the hydrogel could be a good matrix for 3D cell culture.

Hidrogéis de baixo peso molecular (HBPMs) são constituídos por pequenas moléculas que se autoassociam em água através de interações intermoleculares fracas, e que são capazes de encapsular água numa estrutura tridimensional. Os HBPMs podem ser usados em diversas aplicações biomédicas devido ao seu alto conteúdo de água, à sua biocompatibilidade e à sua semelhança com a matriz extracelular. Nos últimos anos vindo a ser desenvolvidos hidrogéis a partir de pequenos péptidos, em particular di- e tripéptidos. Estes hidrogéis são particularmente interessantes devido à sua fácil preparação, à sua variabilidade estrutural e à possibilidade de introduzir diversos grupos biofuncionais. No entanto, o conhecimento das forças que levam à gelificação destes pequenos péptidos ainda requer estudos adicionais. A suscetibilidade à hidrólise enzimática é o principal obstáculo ao uso generalizado de hidrogéis peptídicos. A substituição de aminoácidos naturais por análogos não proteinogénicos é uma das estratégias mais usadas para conferir estabilidade proteolítica a péptidos e proteínas. Neste trabalho foram sintetizados e caracterizados diversos dipéptidos N-protegidos com grupos aromáticos, tais como o naproxeno, o 2-naftilacetilo e o 1-naftoílo. Todos os péptidos continham um desidroaminoácido no segundo resíduo [desidrofenilalanina ( Phe), ácido desidroaminobutírico ( Abu) ou desidroalanina ( Ala)]. Alguns destes desidrodipéptidos revelaram ser biocompatíveis e resistentes a proteases. A gelificação destes péptidos foi testada utilizando alterações de temperatura e pH [adição de ácido clorídrico ou de D-glucono- -lactona (GdL)]. Apenas os desidrodipéptidos contendo pelo menos um aminoácido aromático originaram hidrogéis. Simulações de dinâmica molecular foram usadas para obter dados sobre o mecanismo molecular de autoassociação e racionalizar o design deste tipo de hidrogéis. Verificou-se que os resultados obtidos estavam em excelente concordância com as observações experimentais. A caracterização dos hidrogéis foi realizada utilizando microscopia eletrónica de transmissão (TEM), espectroscopias UV-visível e de fluorescência, dicroísmo circular (CD) e reologia. Os péptidos com unidades aromáticas N-protetoras formaram estruturas altamente organizadas na fase de gel. Os géis consistiam em redes de nanofibras reticuladas com diferentes espessuras e densidades. A reologia demonstrou que as propriedades de elasticidade e de recuperação dos géis variavam para cada péptido. Para o mesmo péptido, as propriedades reológicas dos seus géis dependiam de fatores tais como a concentração de péptido e o pH. Neste trabalho foram reportados os primeiros hidrogéis de dipéptidos com resíduos de triptofano ou com o grupo N-protetor 1-naftoílo. Os últimos originaram hidrogéis com elevada elasticidade e baixas concentrações críticas de gelificação. Num hidrogel de naproxeno-L-Trp-Z- Phe-OH foi incorporado, não covalentemente, um derivado de tieno[3,2-b]piridina com potencial atividade antitumoral. Os estudos de fluorescência e FRET indicaram que o fármaco se fixou num ambiente hidrofóbico, perto ou associado às fibras do péptido, demonstrando a possível aplicação deste tipo de hidrogéis como novos veículos para a entrega controlada de fármacos. Foi igualmente preparado e caracterizado um péptido com o grupo piridina-2,6- dicarboxamida entre dois desidrodipéptidos (L-Phe-Z- Phe). A gelificação deste péptido foi conseguida através de uma alteração de pH. Os géis apresentaram características comparáveis às dos dipéptidos N-protegidos referidos acima. A autoassociação deste péptido foi também estudada em diferentes solventes e na presença de iões metálicos. Um dos desidrodipéptidos N-protegido com naproxeno foi ligado ao epítopo bioativo Arg-Gly-Asp (RGD) para possível aplicação como substituto da matriz extracelular. O péptido naproxeno-L-Ala-Z- Phe-Gly-L-Arg-Gly-L-Asp-Gly-OH deu origem a hidrogéis termorreversíveis e tixotrópicos a pH 6 e baixas concentrações. Após neutralização do péptido, foram obtidos hidrogéis em condições fisiológicas. Observou-se toxicidade celular acima de 0,5 mM, possivelmente devido à formação de agregados. Foi preparado um péptido análogo contendo um resíduo de ácido glutâmico em vez de ácido aspártico (péptido de RGE) que não mostrou toxicidade até 1,2 mM, nem formação de agregados. Simulações de dinâmica molecular mostraram que o péptido de RGD tem apenas uma conformação preferencial, ao contrário do péptido de RGE (três conformações). Resultados preliminares obtidos em culturas 2D de fibroblastos nos géis de RGE mostraram penetração e adesão celular. Este resultado indica que o hidrogel poderá ser utilizado como substituto da matriz extracelular.