Development and characterization of lipid-based nanosystems for controlled release of bioactive compounds

Abstract

The application of nanotechnology to food industry has received great attention from the scientific community. Driven by the increasing consumers’ demand for healthier and safer food products and the need for food grade systems able to encapsulate, protect, and release bioactive compounds, researchers are currently focusing their efforts in nanotechnology to address issues relevant to food and nutrition. Lipid-based nanosystems used as delivery systems are particularly suited for the encapsulation of lipophilic bioactive compounds as it prevents their degradation and improves their bioavailability during gastrointestinal passage. These nanosystems have the potential to revolutionize food industry, once they will allow designing and developing novel functional food products, improving water solubility, thermal stability and bioavailability of bioactive/functional compounds, and enhance sensory attributes and physiological performance of products such as: soft drinks, milk, ice cream, salad dressings, soups, mayonnaise, sauces, dips, butter and margarine. Despite their functionalities, key challenges such as their behaviour within the human gastrointestinal tract and possible toxicity, should first be addressed. Having this background in mind, this thesis aims at developing lipid-based nanosystems for controlled release of lipophilic bioactive compounds, while evaluating their behaviour under gastrointestinal tract conditions and at the same time evaluates the developed nanosystems toxicity towards humans, in model Caco-2 cells. In order to achieve these premises this work a) defines the influence of surfactants and processing conditions in nanoemulsions development; b) evaluates the influence of surface composition in the nanosystems behaviour under gastrointestinal conditions; and c) studies the nanosystems toxicity and their ability to deliver curcumin through Caco-2 cells monolayer. The work performed has shown that nanoemulsions can be produced using high-pressure homogenization and surface composition can be modified using the layer-by-layer (LbL) electrostatic deposition technique. The influence of surfactant and processing conditions on the development and stability of nanoemulsions were evaluated and results showed that processing parameters such as homogenization pressure, surfactant concentration and oil:water ratio significantly affected the Hydrodynamic diameter (Hd) and Polydispersity Index (PdI) values of nanoemulsions. The developed nanoemulsions showed a good kinetic stability (evaluated after centrifugation, heating-cooling cycles and thermal stress) upon measuring the Hd during 28 and 35 days of storage, without visual evidence of creaming and phase separation. Surface composition modification carried through LbL technique resulted in kinetically stable multilayer nanoemulsions. Results showed an encapsulation efficiency of 99.8 ± 0.8 % and a loading capacity of 0.53 ± 0.03 % (w/w) for the nanoemulsion. The presence of the multilayer leads to an increase of the Hd of the nanosystems, from 80.0 ± 0.9 nm (nanoemulsion) to 130.1 ± 1.5 nm (multilayer nanoemulsion). Curcumin release profiles from the nanosystem were evaluated at different conditions and by fitting a linear superimposition model to experimental data the results suggested an anomalous behaviour, being the relaxation of the surfactant and polyelectrolytes the rate-determining phenomena in curcumin release. The effect of the deposition of chitosan and alginate layers onto nanoemulsion systems on curcumin bioaccessibility during in vitro digestion was studied using a dynamic gastrointestinal system that mimicked stomach, duodenum, jejunum and ileum conditions. Results showed that the deposition of a polyelectrolyte layer significantly improved the antioxidant capacity of curcumin during in vitro digestion. In addition, whenever a polyelectrolyte layer was deposited on the nanoemulsion droplets, was observed a better control of the rate and the extent of lipid digestibility by decreasing the hydrolytic activity of lipase when compared to uncoated nanoemulsions. The construction of a chitosan layer increased the bioaccessibility of curcumin, whereas cellular antioxidant activity studies revealed that nanoemulsions and multilayer nanoemulsions had respectively 9 and 10 times higher antioxidant capacity at the cellular level, when compared to pure curcumin. Permeability assays showed that the use of a chitosan layer significantly increased (p<0.05) the apparent permeability coefficient of curcumin through Caco-2 cells by 1.55- fold. In conclusion, this works shows that lipid-based nanosystems can be tailored to increase lipophilic bioactive compounds bioaccessibility or modulate the satiety response by retarding lipid digestion, which can be rather important for the development of functional foods designed for combating obesity, showing great potential for application in food industry.

A aplicação da nanotecnologia na indústria alimentar tem recebido grande atenção por parte da comunidade científica. Impulsionada pela crescente preocupação dos consumidores por produtos alimentares mais saudáveis e seguros e pela necessidade de sistemas edíveis capazes de encapsular, proteger e libertar compostos bioativos, os investigadores estão atualmente a concentrar os seus esforços no uso da nanotecnologia de forma a responder a questões relevantes à alimentação e nutrição. Os nanosistemas lipídicos como sistemas de libertação são particularmente interessantes para a encapsulação de compostos lipofílicos bioativos, uma vez que impedem a sua degradação e melhoram a sua biodisponibilidade durante a passagem gastrointestinal. Estes nanosistemas tem o potencial de revolucionar a indústria alimentar, uma vez que permitirão o desenvolvimento de novos produtos nutraceuticos, melhorar a solubilidade em água, a estabilidade térmica, a biodisponibilidade, atributos sensoriais e o desempenho fisiológico de produtos tais como refrigerantes, leite, gelados, molhos para saladas, sopas, maioneses, manteiga e margarina. No entanto, apesar das suas funcionalidades, existem ainda alguns desafios tais como o seu comportamento no trato gastrointestinal humano e possível toxicidade, que devem de ser abordados. Com estes desafios em mente, esta tese visou o desenvolvimento de nanosistemas lipídicos para a libertação controlada de compostos bioativos lipofílicos, avaliar o seu comportamento sob condições do trato gastrintestinal e, ao mesmo tempo avaliar a toxicidade dos nanosistemas desenvolvidos em células Caco-2. De forma a cumprir estas premissas, este trabalho consistiu em: a) avaliar a influência dos surfactantes e das condições do processo no desenvolvimento de nanoemulsões; b) avaliar a influência da composição de superfície no comportamento nanosistemas sob condições gastrointestinais; e c) determinar a toxicidade e a capacidade dos nanosistemas no transporte de curcumina através de uma monocamada de células Caco-2. O trabalho realizado demonstrou que as nanoemulsões podem ser produzidos utilizando homogeneização de alta pressão e que a composição de superfície das mesmas pode ser alterada utilizando a técnica de deposição eletrostática camada-a-camada (LbL). A influência do surfactante e das condições de processamento foram avaliadas no desenvolvimento e estabilidade das nanoemulsões. Os resultados mostraram que as condições de processamento, tais como pressão de homogeneização, concentração de surfactante e proporção óleo:água afetou significativamente os valores do diâmetro hidrodinâmico e do índice de polidispersibilidade das nanoemulsões. As nanoemulsões desenvolvidas demonstraram boa estabilidade cinética (avaliada após ciclos de centrifugação, de aquecimento e de arrefecimento e stress térmico) através da medição da diâmetro hidrodinâmico durante 28 e 35 dias de armazenamento, sem evidência visual de creaming e separação de fases. A modificação da composição da superfície realizada através da técnica LbL resultou em nanoemulsões multicamadas cineticamente estáveis. Os resultados mostraram uma eficiência de encapsulação de 99,8 ± 0,8 % e uma capacidade de loading de 0,53 ± 0,03 % (w/w) para a nanoemulsão. A presença das multicamadas originou um aumento do diâmetro hidrodinâmico das nanoemulsões de 80,0 ± 0,9 nm (nanoemulsão) para 130,1 ± 1,5 nm (nanoemulsão multicamada). Os perfis de libertação da curcumina dos nanosistemas foram avaliados em diferentes condições. A modelação dos dados experimentais através do modelo linear de sobreposição sugeriu que o transporte da curcumina é devido a um comportamento anómalo, sendo o relaxamento do surfactante e dos polielectrólitos os fenómenos determinantes para a libertação controlada da curcumina. O efeito da deposição de camadas de quitosano e alginato em nanoemulsões foi avaliado com base na bioacessibilidade da curcumina durante digestões in vitro, utilizando um sistema gastrointestinal dinâmico que mimetiza as condições do estômago, duodeno, jejuno e íleo. Os resultados mostraram que a deposição de camadas de polielectrólitos melhorou significativamente a capacidade antioxidante de curcumina durante a digestão in vitro. Além disso, a deposição de camadas de polielectrólitos permitiu um melhor controlo da taxa e extensão da digestibilidade lipídica através da diminuição da atividade hidrolítica da lipase. A construção de uma camada de quitosano aumentou a biodisponibilidade da curcumina, enquanto que estudos de atividade antioxidante celular revelaram que nanoemulsões e nanoemulsões multicamada obtiveram respectivamente 9 e 10 vezes maior capacidade antioxidante a nível celular, quando comparado com a curcumina pura. Ensaios de permeabilidade mostraram que o uso de uma camada de quitosano aumenta significativamente (p<0.05) o coeficiente de permeabilidade aparente da curcumina através de células Caco-2 em 1,55 vezes. Em conclusão, esta trabalho demonstra que os nanosistemas lipídicos podem ser personalizados para aumentar a biodisponibilidade de compostos bioativos lipofílicos ou modular a saciedade ao retardar a digestão dos lípidos, o que pode ser importante para o desenvolvimento de alimentos funcionais concebidos para o combate à obesidade, mostrando um grande potencial para futuras aplicações na indústria alimentar.