Chemical functionalization in bionanoparticles

Abstract

Asparaginase is an enzyme that has been extensively used for the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) and other lymphoproliferative malignancies. This enzyme catalyzes the hydrolysis of asparagine into aspartic acid and ammonia, resulting in leukemic cancer cells death. One of the side-effects of asparaginase therapy is hyperammonemia that is caused by an abrupt elevation of ammonia levels in plasma after asparaginase therapy and can lead to cerebral edema, herniation, coma, and even death. The main objective of the work was the development of asparaginase immobilized nanoparticles with the capacity to retain at surface the free ammonia, reducing the levels of circulating ammonia and avoiding hyperammonemia. The BSA particles were produced by two high-energy emulsification methods, ultrasounds and high pressure homogenization. In terms of physical characteristics, the best nanoparticles were the ones prepared by homogenization, since the particles where in the nano-range (lower than 200 nm) and exhibit a lower PDI. Relatively to the activity, all the particles produced by ultrasounds almost lost the asparaginase activity after storage for two months at 4 ºC. For this particles, two surfactants were tested, Poloxamer 407 and zein, in order to stabilize the particles. Generally with the surfactants, it was observed an improvement on asparaginase activity during the first month, still the enzyme activity decreased almost to zero after two months. All the particles prepared by homogenization, except the BSA:Asparaginase:Pol407 D, also lost the activity after two months at 4 ºC. The BSA:Asparaginase:Pol407 D were the only particles that stabilize the enzyme and retain 87 % of the initial activity two months after immobilization. The development of a new HPLC-MS method to quantify the asparagine and aspartic acid together with the ammonia quantification by Nesslerization, confirmed the ability of the particles with asparaginase to retain the ammonia resulting from the asparaginase activity. This capacity to retain ammonia could be used to avoid hyperammonemia during the treatment of ALL. The cytotoxic effect of the particles prepared by ultrasounds and tested regarding their ability to retain ammonia, was evaluated using the mouse leukemic macrophage cell line RAW 264.7. The particles which displayed more cytotoxicity to the cells were the ones with zein on the formulation; while the BSA:Asparaginase B particles did not show any cytotoxic effect with a cellular viability around 93 % for all tested concentrations. Generally, the cells incubated with the particles had cellular viability always superior to 73 %.

A asparaginase é uma enzima que tem sido vastamente utilizada para o tratamento da Leucemia Linfoblástica Aguda (ALL) e outras doenças linfoproliferativas. Esta enzima catalisa a hidrólise da asparagina em ácido aspártico e amónia, resultando na morte das células leucémicas. Um dos efeitos colaterais desta terapia é a hiperamonemia, causada por uma elevação abrupta dos níveis de amónia no plasma sanguíneo, podendo resultar em edemas cerebrais, coma ou até morte. O principal objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de nanopartículas onde a asparaginase pudesse ser imobilizada e com a capacidade de reter a amónia livre, reduzindo assim os níveis de amónia no plasma e evitando a hiperamonemia. As partículas de BSA foram produzidas por dois métodos de alta-energia, os ultrassons e a homogeneização de alta-pressão. Em termos de características físicas, as melhores partículas foram as preparadas por homogeneização, uma vez que apresentavam um tamanho inferior a 200 nm e exibiam um baixo PDI. Relativamente à atividade, todas as partículas preparadas por ultrassons apresentavam uma atividade da asparaginase muito baixa ou nula após dois meses a 4 ºC. De modo a estabilizar estas partículas, foram testados dois surfactantes, Poloxamer 407 e zeína. Globalmente, a adição de surfactantes melhorou a atividade da asparaginase durante o primeiro mês, dimunuindo quase até zero após dois meses. Todas as nanopartículas preparadas por homogeneização, exceto as BSA:Asparaginase:Pol407 D, também perderam a atividade após dois meses a 4 ºC. As nanopartículas BSA:Asparaginase:Pol407 D demostraram ser as únicas partículas capazes de estabilizar a enzima, retendo 87 % da atividade inicial mesmo dois meses após imobilização. O desenvolvimento do método de HPLC-MS para quantificar simultaneamente a asparagina e ácido aspártico, em conjunto com a quantificação de amónia pelo método de Nessler, confirmaram a capacidade das partículas com asparaginase em reter a amónia resultante da atividade desta enzima. Esta capacidade para reter a amónia livre pode ser utilizada para evitar a hiperamonemia durante o tratamento da ALL. A citotoxicidade das partículas preparadas por ultrassons, as mesmas testadas relativamente à sua capacidade em reter amónia, foi avaliada com a linha celular de macrófagos de ratinho RAW 264.7. As partículas que demostraram uma maior citotoxicidade foram aquelas que incluíam zeina na sua formulação; as partículas BSA:Asapraginase B não demonstraram qualquer citotoxicidade, apresentando uma viabilidade celular superior a 93 % para todas as concentrações testadas. De um modo geral, as células incubadas com todas as partículas apresentaram uma viabilidade celular superior a 73 %.