Influence of oxygen conditions on bacterial interactions within biofilms related with cystic fibrosis

Abstract

Cystic Fibrosis (CF) is a genetic disorder associated with multispecies infections where interactions between classical and newly identified bacteria might be crucial for a better understanding of their persistent colonization in CF lungs. Nonetheless, little is known about the contributions of these microbes in the development of chronic biofilms, particularly under variable oxygen environments that are known to occur in vivo in the airways of CF patients. As such, this work aimed at giving insights into the physiology, phenotype and ecology of polymicrobial communities involving traditional (Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa) and emergent bacteria (Achromobacter baumannii, Dolosigranulum pigrum, Inquilinus limosus, Klebsiella pneumoniae and Stenotrophomonas maltophilia) associated to CF. At a first stage of this work, the ability of abovementioned bacteria to growth planktonically and to develop biofilms under in vitro atmospheres with different oxygen concentrations (aerobic and anaerobic) was examined. Results showed that all bacteria were able to growth and to develop biofilms under such conditions, demonstrating high number of cultivable cells even with a significant decreasing in the amount of biomass for low-oxygen atmospheres. Based on these initial findings, that revealed an easy adaptation of the emergent-species to the CF airways environments, it was considered crucial to investigate how they interact and contribute to the polymicrobial consortia when cultured with CF-common pathogens. As such, S. aureus, I. limosus and S. maltophilia were grown in dual-species populations with P. aeruginosa under variable oxygen atmospheres and these biofilms were thoroughly characterized for biomass, colony-forming units (CFU) and relative distribution of bacterial populations. Results demonstrated that dual-species biofilms, similarly to most single-species biofilms, produced more biomass under aerobic conditions. However, the presence of S. aureus, I. limosus and S. maltophilia in co-culture with P. aeruginosa significantly reduced the biofilm biomass formed comparatively with the mono-species P. aeruginosa biofilm, although the number of cultivable cells was not affected. Regarding microbial composition, the results obtained by CFU counting and PNA FISH under aerobic and anaerobic atmospheres, demonstrated that in all polymicrobial consortia, P. aeruginosa was still the dominant species. The latest results have shown that populations encompassing CF-bacteria could easily adapt to planktonic and biofilm state under variable oxygen conditions resembling CF. But how these microorganisms contribute to disease progression and to antibiotic therapy was still to be unveiled. As such, those bacterial populations were grown under variable oxygen conditions and their antibiotic resistance profiles using ciprofloxacin were assessed. Results indicate that biofilms were notoriously more difficult to eradicate than their planktonic counterparts, for all oxygen atmospheres. Regarding polymicrobial populations, biofilm eradication was not achieved by using monotherapy, showing even an increased overall cell density when compared with mono-species P. aeruginosa biofilm, in all oxygen conditions. In general, biofilm compositions changed as a result of antibiotic treatment, with alterations being dependent on the antibiotic concentration and oxygen conditions implemented. For consortia formed between P. aeruginosa and S. aureus, the latter species predominated in the consortia for both oxygen conditions. Contrariwise, the consortia encompassing P. aeruginosa – I. limosus and P. aeruginosa – S. maltophilia were dominated by the CF-key pathogen P. aeruginosa. As such, the endurance of P. aeruginosa within the consortia, before and after antibiotic treatment, could be the basis for a higher contribution of this species to the antibiotic resistance presented by dual-species biofilms. However, the increasing survival of S. maltophilia and I. limosus (slight increase for I. limosus) in dual-species consortia with P. aeruginosa after antibiotic exposure, for all oxygen atmospheres, indicates that these species may have also a preponderant role in increasing the whole resistance within the consortia. The PNA FISH method was employed to directly localize and discriminate the bacterial populations within the consortia, corroborating the dominance of P. aeruginosa within the mixed-species consortia (determined by CFU counting), and allowed to observe a decreasing in the overall cell density for all consortia under low-oxygen atmospheres. In summary, the results demonstrated that emergent- and traditional-species are able to live in association with key-CF pathogen P. aeruginosa commonly found in CF airways under variable oxygen atmospheres, developing highly resilient consortia towards antibiotic treatment. The interactions established between emergent-species and other major pathogens might be crucial to understanding the persistent microbial infection in CF airways and bring information about the pathogenic character of such emergent species.

A Fibrose Cística (FC) é uma doença genética associada a infecções multiespécie em que as interações, entre bactérias clássicas e recentemente identificadas, podem ser cruciais para melhor compreender a sua persistente colonização nos pulmões de pacientes com FC. No entanto, a contribuição destes microrganismos no desenvolvimento de biofilmes crônicos, particularmente em ambientes com diferentes concentrações de oxigênio como ocorrem in vivo nas vias respiratórias de pacientes com FC, é pouco compreendida e estudada. Neste cenário, este trabalho teve como objectivo contribuir para o conhecimento da fisiologia, fenótipo e ecologia de comunidades polimicrobianas envolvendo bactérias tradicionais (Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa) e emergentes (Achromobacter baumannii, Dolosigranulum pigrum, Inquilinus limosus, Klebsiella pneumoniae e Stenotrophomonas maltophilia) associadas à FC. Na primeira etapa do trabalho foi investigada a capacidade das bactérias acima referidas crescerem planctónicamente e desenvolver biofilmes in vitro em atmosferas com diferentes concentrações de oxigênio (aerobiose e anaerobiose). Os resultados mostraram que todas as bactérias exibiram capacidade para crescer e desenvolver biofilmes em tais condições, atingindo um elevado número de células cultiváveis mesmo com uma diminuição significativa na quantidade de biomassa formada para ambientes com deficiência em oxigénio. Com base nestes resultados preliminares, que revelaram uma fácil adaptação das espécies emergentes a ambientes similares aos das vias respiratórias de pacientes com FC, considerou-se crucial investigar como estas bactérias interagem entre si e contribuem para a resposta global dos consórcios polimicrobianas quando cultivadas com patogéneos comumente associados à FC. Desta forma, desenvolveram-se biofilmes duplos envolvendo S. aureus ou I. limosus ou S. maltophilia com P. aeruginosa em concentrações de oxigénio variáreis, tendo sido, posteriormente, caracterizados relativamente à quantidade de biomassa, células cultiváveis e distribuição relativa de populações bacterianas. Os resultados demonstraram que os biofilmes duplos, tal como os simples, produziram maior quantidade de biomassa em condições aeróbias. No entanto, a presença de S. aureus, I. limosus e S. maltophilia em co-cultura com P. aeruginosa reduziu significativamente a quantidade de biomassa dos biofilmes duplos formados, comparativamente com o biofilmes simples de P. aeruginosa, embora o número de células cultiváveis não fosse afectado. Em termos de composição microbiológica, os resultados obtidos por contagem de células cultiváveis e PNA FISH sob atmosferas aeróbias e anaeróbias, demonstrou que em todos os consórcios polimicrobianos P. aeruginosa foi a espécie dominante. Como demostrado, bactérias associadas à FC parecem adaptar-se facilmente a ambientes com diferentes gradientes de oxigénio, crescendo planctónicamente e em biofilme. No entanto, não há ainda muita informação acerca de como esses microrganismos contribuem para a progressão da doença e reagem à antibioterapia, nas várias condições de oxigénio existentes nas vias respiratórias da FC. Sendo assim, os seus perfis de resistência à ciprofloxacina sob condições variáveis de oxigênio foram avaliados. Os resultados indicam que os biofilmes foram notoriamente mais difícil de erradicar do que as células planctónicas, para todas as atmosferas de oxigênio. Relativamente às populações polimicrobianas, a erradicação de biofilmes não foi conseguida através da monoterapia (ciprofloxacina), havendo mesmo um aumento da densidade celular quando comparado com o biofilme de P. aeruginosa, em todas as condições de oxigênio. De um modo geral, a composição de biofilmes polimicrobianos dependente da concentração do antibiótico e das condições de oxigénio implementadas. No caso dos biofilmes duplos formados entre P. aeruginosa e S. aureus, a última espécie predominou o consórcio para ambas as condições de oxigénio. Pelo contrário, os biofilmes duplos que englobam P. aeruginosa - I. limosus e P. aeruginosa - S. maltophilia foram dominados pela P. aeruginosa. Estes dados parecem indicar que a resistência dos consórcios polimicrobianos, antes e após o tratamento com ciprofloxacina, poderá estar na base de uma maior contribuição da P. aeruginosa. No entanto, o aumento da proporção de S. maltophilia e I. limosus (ligeiro aumento no caso de I. limosus) nos biofilmes duplos após a exposição à ciprofloxacina, em condições de aerobiose e anaerobiose, parece indicar que essas espécies têm um papel preponderante no aumento da resistência global dos consórcios. O método PNA FISH foi utilizado para localizar e distinguir as populações bactérias nos consórcios polimicrobianos, corroborando com a dominância de P. aeruginosa nos consórcios polimicrobianos, e com a diminuição na densidade celular dos consórcios para atmosferas com baixa concentração de oxigênio. Conclui-se assim, que ambas as espécies (tradicionais e emergentes) são capazes de viver em associação com P. aeruginosa adaptando-se facilmente a condições de oxigénio semelhantes às encontradas nas vias respiratórias dos pacientes com FC, originando consórcios polimicrobianos com resistência a antibióticos aumentada. Assim, avaliar as interações estabelecidas entre espécies emergentes e tradicionais associadas à FC pode ser crucial para compreender as infecções microbianas persistentes que ocorrem nas vias aéreas de pacientes com FC, e trazer informações sobre a verdadeiro papel patogênico das espécies emergentes.