Production of recombinant carbohydrate-binding modules in Pichia pastoris and their application in the modification of paper fibers

Abstract

Enzymes have been widely applied in the paper industry for the modification of pulp and paper properties. Although they have the potential to replace hazardous chemicals, their use in the hydrolysis of polysaccharides reduces both fiber strength and mass. To overcome these negative effects, the potential use of recombinant carbohydrate-binding modules (CBMs) in papermaking, has been receiving growing attention. A CBM is defined as a contiguous amino-acid sequence within a carbohydrate-active enzyme, presenting an independent fold and function, and carbohydrate-binding activity. In addition, glycosylation in fungal CBMs has been suggested to be important for the modification of pulp and paper properties In order to improve cellulose fibers from the paper industry using an enzyme-free process, consisting of recombinant CBMs, we aimed to: (1) clone and produce in Pichia pastoris recombinant CBM1 from Trichoderma reesei (fungus) and CBM3 from Clostridium thermocellum (bacteria), (2) optimize the production and purification of the recombinant CBMs by immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) and (3) characterize the cellulose-binding capacity of the recombinant CBMs and study their effects in the properties of pulp (drainability) and paper fibers (wetability, bursting and tensile strengths, lengthening, tearing and air permeability). Recombinant CBM1 fused to enhanced green fluorescent protein (eGFP), directly or by the native glycosylated CBM linker, was produced at high levels but mainly as intracellular protein. Their purification from P. pastoris cell-free extracts by IMAC resulted in low amounts, which compromised their characterization and application. Nevertheless, the two purified recombinant CBM-fusions were able to bind to cellulose. On the other hand, both recombinant versions of CBM3, glycosylated and non-glycosylated, were produced as secreted proteins with the nonglycosylated CBM3 exhibiting higher cellulose-binding affinity than the glycosylated version. Regardless of the lack of effect on pulp drainability, both CBM3 versions improved significantly the mechanical properties of Eucaliptus globulus papersheets, namely the burst and tensile strength indexes, up to 12% and 10% (in papersheets made of E. globulus pulp treated with nonglycosylated CBM3), respectively. In addition, non-glycosylated CBM3 decreased significantly the wetability and air permeability of papersheets. However, both recombinant CBM3 versions did not have any effect on papersheets made of a mixture of E. globulus and Pinus sylvestris (30:70) pulp. The modification of paper fibers by recombinant CBM3 was dependent on its concentration but not on its glycosylation. These results indicate that recombinant CBM3 play an important role in the improvement of surface/interface properties of cellulose fibers, contributing to paper products with higher quality.

As enzimas têm sido amplamente aplicadas na indústria de papel para a modificação das propriedades de pasta e papel. Embora tenham o potencial para substituir produtos químicos perigosos, a sua utilização na hidrólise de polissacarídeos reduz a massa e a resistência das fibras. De forma a ultrapassar estes efeitos negativos, tem-se dado cada vez mais atenção à potencial utilização de módulos recombinantes de ligação a carbohidratos (CBMs) no fabrico de papel. Um CBM é definido como uma sequência de aminoácidos de uma enzima, que apresenta uma estrutura e função independentes, bem como atividade de ligação a carbohidratos. Além disso, a glicosilação dos CBMs de origem fúngica tem sido sugerida como importante para a modificação das propriedades da pasta e do papel. De forma a melhorar as fibras de celulose da indústria de papel, utilizando um processo sem enzimas, e que consiste na utilização de CBMs recombinantes, propusemo-nos a: (1) clonar e produzir em Pichia pastoris o CBM1 recombinante de Trichoderma reesei (fungo) e o CBM3 de Clostridium thermocellum (bactéria), (2) optimizar a produção e purificação dos CBMs recombinantes por cromatografia de afinidade com iões metálicos imobilizados (IMAC) e (3) caraterizar a capacidade de ligação à celulose dos CBMs recombinantes e estudar os seus efeitos nas propriedades de pasta (drenabilidade) e fibras de papel (molhabilidade, rutura, resistência à tração, alongamento, rasgamento e permeabilidade ao ar). O CBM1 recombinante fundido com a proteína verde fluorescente (eGFP), diretamente ou através do linker glicosilado nativo do CBM, foi produzido em níveis elevados, mas sobretudo de forma intracelular. A sua purificação a partir de extratos celulares de P. pastoris por IMAC resultou em baixas quantidades, o que comprometeu a sua caraterização e aplicação. No entanto, as proteínas de fusão eGFP-CBM purificadas apresentaram capacidade de ligação à celulose. Por outro lado, ambas as versões recombinantes do CBM3 foram produzidas em grande quantidade no meio de cultura, tendo a versão não glicosilada apresentado uma maior afinidade de ligação à celulose. Independentemente de não terem alterado a drenabilidade de pastas de papel, ambas as versões recombinantes do CBM3 melhoraram significativamente as propriedades mecânicas das folhas de papel de Eucaliptus globulus, nomeadamente, os índices de rutura e de resistência à tração, até 12% e 10% (em folhas de papel feitas a partir de pasta E. globulus tratada com a versão não glicosilada do CBM3), respetivamente. Além disso, a versão não glicosilada do CBM3 diminuiu significativamente a molhabilidade e permeabilidade ao ar das folhas de papel. Contudo, ambas as versões recombinantes do CBM3 não provocaram qualquer efeito em folhas de papel feitas a partir de pasta E. globulus e Pinus sylvestris (30:70). A modificação das fibras de papel pelo CBM3 recombinante foi dependente da sua concentração, mas não da sua glicosilação. Estes resultados indicam que o CBM3 recombinante desempenha um papel importante na melhoria das propriedades superficiais/interfaciais de fibras de celulose, contribuindo para produtos de papel com maior qualidade.