Enzyme engineering for improved xylanase applicability and characterization of a xylan metabolizing Saccharomyces cerevisiae

Abstract

A xylanase (pXyl) isolated from the Antarctic bacterium Pseudoalteromonas haloplanktis is being commercialized worldwide for use in the baking industry. pXyl is a highly active coldadapted enzyme belonging to glycoside hydrolase family 8. It maintains high activity at low temperatures, is resistant to xylanase inhibitors and is highly specific for long chain unsubstituted xylan. However, a low stability and activity at acidic pHs, due mainly to precipitation, prevents the use of this enzyme in other industrial activities. In this study, the protein engineering techniques of random mutagenesis and site directed mutagenesis were investigated in an attempt to overcome the instability and loss of activity of pXyl at acidic pHs. Initially, random mutagenesis was investigated as this offers a powerful tool for identification of novel positive mutations in the absence of any knowledge of the protein involved. A critical limitation with this approach is the availability of a high throughput screening method for facile identification of positive mutants. We investigated an in-house strain of Saccharomyces cerevisiae for use in genetic complementation screening. This host has been engineered to enable growth on xylose and here it was attempted to develop this for growth on xylan by inclusion of both a β-xylosidase gene and the gene for pXyl. Unfortunately, following multiple attempts we were unable to isolate a strain capable of growth with xylan as the sole carbon source. We next turned our attention to site-directed mutagenesis. It is proposed that the strong precipitation of pXyl at low pHs may be related to its highly hydrophobic surface, as well as to negative surface amino acids which become protonated and more hydrophobic and hence more prone to precipitation at these lower pHs. Therefore, the highly exposed negative residues which do not participate in stabilising interactions in pXyl were identified (D70, E94, E95, E342 and E377) and mutated to the highly polar residue serine in an attempt to reduce acidic pH precipitation. Only E94S and E342S were successfully produced, purified and characterised. Both mutants showed minor increases in solubility at both acidic and basic pHs as compared to the wild-type enzyme, as well as an improvement in thermal stability, albeit being accompanied by alterations in the conformation. This preliminary study indicates the potential of the approach used in overcoming pXyl precipitation at acidic pHs.

A enzima xilanase (pXyl) isolada da bactéria antártica Pseudoalteromonas haloplanktis está mundialmente a ser comercializada como aplicação na indústria de panificação. A pXyl é uma enzima extremamente ativa e adaptada a baixas temperaturas, pertencendo à glycoside hydrolase family 8. Esta mantém uma elevada atividade a baixas temperaturas, é resistente a inibidores de xilanases e é específica para xilanos de cadeia longa não substituídos. No entanto, a baixa estabilidade e atividade a pHs ácidos, devido principalmente à sua precipitação nesta condição, impede a utilização desta enzima noutras áreas industriais. Neste estudo, as técnicas de engenharia de proteínas, mutagénese aleatória e mutagénese dirigida, foram utilizadas com o objetivo de superar a instabilidade e a perda de atividade da pXyl a pHs ácidos. Inicialmente, foi investigada a mutagénese aleatória, uma vez que esta técnica oferece uma estratégia poderosa para a identificação de novas mutações positivas nos casos em que a proteína envolvida não é totalmente conhecida. Uma limitação preponderante no uso desta abordagem é a disponibilidade de um método de rastreio de alto rendimento para a fácil identificação de mutantes positivos. Por isso, uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae construída no nosso laboratório foi investigada para o seu uso no rastreio de complementações genéticas. Neste trabalho, este hospedeiro, previamente geneticamente manipulado para crescer em xilose, foi também adaptado para poder crescer em xilano. Para isso, os genes que codificam para uma β - xilosidase e para a pXyl foram expressos nesta estirpe. Infelizmente, após várias tentativas, não foi possível isolar uma estirpe capaz de crescer em xilano como única fonte de carbono. A segunda parte do trabalho focou-se na mutagénese dirigida. Estudos relacionados propõe que a forte precipitação da pXyl a pH baixos pode estar relacionada com a sua superfície altamente hidrofóbica, assim como com os aminoácidos negativos superficiais que se tornam protonados e mais hidrofóbicos e, portanto, mais propensos à precipitação nestes pHs. Por conseguinte, os resíduos negativos mais expostos ao solvente que não participam em interações de estabilização na pXyl foram identificados (D70, E94, E95, E342 e E377) e mutados por serina, um resíduo fortemente polar, numa tentativa de reduzir a precipitação a pH ácido. Apenas os mutantes E94S e E342S foram produzidos, purificados e caraterizados com sucesso.Ambos os mutantes apresentaram um ligeiro aumento na solubilidade tanto a pHs ácidos como básicos em comparação com a enzima selvagem assim como um aumento na estabilidade térmica, embora acompanhados por alterações na conformação. Este estudo preliminar indica o potencial da abordagem utilizada na diminuição da precipitação da pXyl a pHs ácidos.