Biosurfactants production by probiotic bacteria and inhibition of voice prostheses microbial colonization

Abstract

The main purposes of this thesis were the optimization of fermentation conditions for the production of biological antifouling agents, namely biosurfactants from probiotic bacteria, in order to develop new strategies for the prevention of microbial colonization of silicone rubber voice prostheses. Probiotic bacteria Lactococcus lactis 53 and Streptococcus thermophilus A were found to be biosurfactant¬producing strains. The improvement of the standard culture medium for biosurfactant production by response surface methodology, using a compilation of mathematical and statistical techniques, was used and an effective increase in the production yields was achieved. Economical alternatives were pursed using non conventional low cost raw materials as molasses or cheese whey instead of synthetic medium. An improvement of biosurfactants production yields with 60 to 80% medium preparation costs reduction was achieved. The ability of the biosurfactants obtained from probiotic bacteria to inhibit adhesion of microbial strains isolated from explanted voice prostheses to silicone rubber surfaces with and without an adsorbed biosurfactant layer was studied in a parallel plate flow chamber. Biosurfactants produced by the L. lactis 53 and S. thermophilus A reduced about 90% both deposition rates and number of adhering microorganisms after 4 hours. The biosurfactant obtained from S. thermophilus A proved to be much more efficient against Rothia dentocariosa GBJ 52/2B that is the most frequently isolated bacteria in the group of patients whose prostheses fail after a short time of use forcing replacement. An artificial throat model was used to assess the influence of biosurfactants from probiotic bacteria on the formation of voice prosthetic biofilms. Both biosurfactants were found to be antimicrobial agents and greatly reduced microbial numbers on prostheses and also induced a decrease in the airflow resistance of voice prostheses after biofilm formation. The key components of the crude biosurfactant mixtures produced by L. lactis 53 and S. thermophilus A, including their molecular composition (by Fourier transform infrared spectroscopy), elemental composition (by X-ray photoelectron spectroscopy), molecular mass (by mass spectrometry) and monosaccharide composition (by gas-liquid chromatography) were studied. Moreover, partial functional characterization was established using the following techniques: blood agar test, oil spreading test, critical micelle concentration determination, antimicrobial activity and anti-adhesion test. Finally, desorption of biosurfactants from silicone rubber and their stability at several pH were evaluated. The most surface-active fractions isolated from the crude biosurfactant mixtures were found to be rich in glycoproteins and glycolipids for L. lactis 53 and S. thermophilus A, respectively. In addition, these fractions showed antimicrobial and anti-adhesive activities against microbial strains isolated from explanted voice prostheses. Furthermore, the most surface-active fractions stay adsorbed onto silicone rubber surfaces up to 2 months at effective concentrations against microbial colonization. Therefore an increase in voice prostheses lifespan is achievable, as well as the consequent reduction of the health costs associated with prostheses replacement.

A presente tese teve como principais objectivos a optimização das condições fermentativas para a produção de compostos inibidores da adesão microbiana, nomeadamente biosurfactantes, por bactérias probiólicas; de forma a desenvolver novas estratégias de prevenção da colonização microbiana das próleses da fala. Demonstrou-se que as bactérias probióticas Lactococcus lactis 53 e Streptococcus thermophilus A são estirpes produtoras de biosurfactantes. O melhoramento dos meios de cultura para a produção de biosurfactantes foi efectuado usando a metodologia de optimização factorial, fazendo recurso a uma série de ferramentas matemáticas e estatísticas, tendo-se obtido um efectivo aumento dos rendimentos de produção. Alternativas mais económicas foram desenvolvidas usando matérias-primas não convencionais de baixo custo, como os melaços e o soro de queijo. Atingiu-se uma melhoria razoável dos rendimentos de produção de biosurfactantes tendo sido estimado um decréscimo de 60-80% dos custos associados. A capacidade dos biosurfactantes de inibir a adesão de microorganismos isolados de próteses da fala (removidas de doentes) a superfícies de borracha de silicone com e sem uma camada de biosurfactante adsorvida, foi estudada usando para o efeito uma célula de fluxo laminar. Ambos os biosurfactantes promoveram uma redução de cerca de 90% das taxas de deposição iniciais de microorganismos, bem como do número tolal de microorganismos aderidos ao final de 4 horas. O biosurfactante obtido a partir de S. thermophilus A provou ser muito mais eficiente na inibição da adesão de Rothia dentocariosa GBJ 52/2B que é a bactéria mais frequentemente isolada em doentes cujas próteses falham após um curto período de uso, forçando a sua substituição. Um modelo de garganta artificial com próteses da fala foi utilizado para estudar o efeito dos biosurfactantes na formação de biofilmes. Ambos os biosurfactantes apresentaram actividade antimicrobiana e reduziram significativamente o número de microorganismos presentes nas próteses, bem como promoveram um decréscimo da resistência à passagem de ar através da válvula da prótese. Os biosurfactantes produzidos por L. lactis 53 e S. thermophilus A foram parcialmente purificados numa coluna de interacção hidrofóbica. As estruturas físico-químicas e características funcionais das fracções isoladas foram estudadas. A composição molecular (por FTIR) , a composição elementar (por XPS), a massa molecular (por espectrometria de massa) e a composição em açúcares simples (por cromatografia gasosa) foram estudadas. A caracterização funcional foi estabelecida com recurso a técnicas como: teste do agar de sangue para avaliar a actividade hemolítica; teste para avaliar a dispersão de óleos; determinação da concentração micelar crítica e a determinação das actividades antimicrobianas e anti-adesivas. Adicionalmente foi efectuado um estudo da desorção das fracções activas ligadas a superfícies de borracha de silicone, bem como da sua estabilidade a vários valores de pH. Concluiu-se que as fracções com maior actividade de superfície obtidas a partir de L. lactis 53 e S. thermophilus A são ricas em glicoproteinas e glicolipidos, respectivamente. Estas fracções demonstraram possuir actividade antimicrobiana, bem como anti-adesiva contra os microorganismos isolados de próteses de doentes. Finalmente, verificou-se que as fracções com maior actividade de superfície permanecem adsorvidas à borracha de silicone até cerca de 2 meses em concentrações inibitórias da colonização microbiana, o que poderá permitir um aumento do tempo de vida das próteses da fala e consequentemente reduzir os custos de saúde associados à sua frequente substituição