Molecular characterization of flower development of Quercus suber L

Abstract

Quercus suber, or cork oak, is an important forest species in Southern Europe and Northern Africa. This perennial monoecious species has an accentuated protandrous system: in late winter, and sometimes in autumn, male flowers develop in catkins that emerge close to the dormant buds. Female flowers develop in spring (4 to 8 weeks after male flowering) in a process that takes more than one month to full completion. Both male and female flowers are unisexual at inception with no evidence of aborted sexual organs. Cork oak has also a long juvenile phase and a long progamic phase. The progamic phase is characterized by the arrest of pollen tube growth that lasts until the full development of the embryo sac. Despite the importance of this species (economical and ecological), very little is known regarding the genetic mechanisms involved in cork oak reproduction mainly due to the lack of molecular resources that has hampered the ability to perform functional studies in this species. The main aim of this thesis was the study of the reproductive characteristics of Q. suber using distinct molecular approaches. Non-normalised cDNA libraries of male and female flowers were generated using 454 pyrosequencing technology in order to identify differentially expressed genes during the development of male and female flowers of Q. suber. Comparative analysis of the transcriptomes revealed genes differentially expressed in early and late stages of development of female and male flowers, some of which are involved in flower development of other species. These differentially expressed genes included MADS-box genes homologous to the regulatory floral homeotic genes (ABCDE model). The temporal expression of these genes (some are sex-biased) and the identification of new protein-protein interactions suggest that the development of unisexual flowers of Q. suber may be under control of specific changes in the dynamics of the ABCDE model. The cork oak pronounced protandric nature was further studied by identifying the flowering induction events during the reproductive season. Expression of Q. suber homologues of recognized flower inducers suggests that male and female flower primordia are established at different time points in the growing season. Female flowers are induced in spring after bud dormancy break, whereas male flowers are induced in late summer before the establishment of bud dormancy, but fully develops in late winter, which implies a long anthesis period that spans dormancy. The establishment of two flower induction periods separated by a long anthesis period might explain abnormal flowering events that are common in Q. suber and other dichogamic species, such as the display of only one type of flower in one or successive reproductive seasons. The changes that occur during male and female reproductive organs development were further characterised during the relatively long cork oak progamic phase. The distribution of Arabinogalactan-Proteins (AGPs) and pectin epitopes was characterized in anthers and pistils. AGP genes involved in cork oak flower development were also identified. The selective labeling obtained with monoclonal antibodies during Q. suber reproductive organs development, shows that AGPs and pectins are good markers for mapping male and female gametophytic cell lineages in this species. Several cork oak AGP genes were classified as predominantly male or female based on their expression in the flowers. The functional role of these AGP genes in other species suggests that AGPs play a significant role in cork oak reproduction. Taken together, this thesis provides a deeper understanding on distinct reproductive characteristics of Q. suber. Furthermore, the mechanisms here described serve as platform to explain molecular events controlling flower development of a wide range of other angiosperm species with similar reproductive habits.

Quercus suber, ou sobreiro, é uma espécie fundamental para os ecossistemas florestais do sul da Europa e de Norte de África. Esta espécie perene e monoica tem um sistema protândrico pronunciado: no final do inverno e também no outono, as flores masculinas desenvolvem-se perto dos gomos dormentes em forma de amentilhos. As flores femininas desenvolvem-se na primavera, 4 a 8 semanas depois da emergência das flores masculinas. As flores masculinas e femininas são unissexuais sem qualquer evidência morfológica de órgãos abortados. O sobreiro também possui outras características reprodutivas que o distinguem, nomeadamente uma longa fase juvenil e progâmica. A longa fase progrâmica é caracterizada pela paragem de crescimento do tubo polínico no tecido de transmissão até ao completo desenvolvimento do saco embrionário. Apesar da sua importância económica e ambiental pouco se sabe sobre os mecanismos genéticos envolvidos na reprodução do sobreiro. Isto poderá dever-se à falta de recursos moleculares que têm atrasado um estudo pormenorizado sobre os mecanismos reprodutivos desta espécie. O objectivo principal desta tese foi estudar as características reprodutivas do sobreiro usando diferentes abordagens moleculares. Bibliotecas de cDNA não-normalizadas de flores masculinas e femininas de sobreiro foram obtidas por pirosequenciação de forma a identificar genes diferencialmente expressos durante o desenvolvimento das flores masculinas e femininas. Uma análise comparativa dos transcriptomas revelaram genes diferencialmente expressos em fases iniciais e finais do desenvolvimento floral, muitos dos quais estão envolvidos no desenvolvimento floral de outras espécies. Alguns destes incluíam genes MADSbox homólogos de reguladores homeóticos florais (do modelo ABCDE de regulação floral). O perfil de expressão dos genes MADS-box (alguns com regulação dependente do género) juntamente com a identificação de novas interações proteína-proteína sugere que o desenvolvimento de flores unissexuais no sobreiro poderá estar sob o controlo de alterações na dinâmica do modelo ABCDE. A natureza protândrica da floração do sobreiro foi investigada mais profundamente ao identificar o período de indução floral. A expressão de indutores florais em tecidos de sobreiro sugere que as flores masculinas e femininas são induzidas em pontos distintos da época de crescimento ativo: as flores femininas são induzidas na primavera após a quebra da dormência apical enquanto que a indução da floração masculina ocorre no final do verão, ou seja, antes do estabelecimento da dormência, o que implica um longo período de ântese que ocorre durante a fase de dormência. A ocorrência de dois períodos de indução separados por um longo período de ântese poderá explicar eventos anormais de floração que são recorrentes no sobreiro e em outras espécies dicogâmicas, tal como o desenvolvimento de apenas um tipo de flor em épocas reprodutivas consecutivas. De forma a caracterizar a fase progâmica do sobreiro foram estudadas as diferentes fases de desenvolvimento das anteras e dos pistilos. A caracterização foi efectuada estudando a distribuição de epítopos de proteínas Araninogalactânicas (AGPs) e pectinas em diferentes tecidos reprodutivos e pela análise da expressão de genes codificando AGP potencialmente envolvidos no desenvolvimento floral do sobreiro. A marcação diferencial com anticorpos monoclonais demonstrou que AGPs e pectinas são excelentes marcadores para identificar fases específicas no desenvolvimento das flores masculinas e femininas. Além disso, a análise do perfil de expressão de vários genes AGP, permitiu classificar alguns destes genes como sendo preferencialmente expressos nas flores masculinas ou femininas, sugerindo um papel no processo reprodutivo do sobreiro. Os resultados apresentados nesta tese representam uma abordagem aprofundada do desenvolvimento reprodutivo do sobreiro e poderão servir de plataforma para o estudo de espécies de alto valor económico e ecológico com características reprodutivas semelhantes.