Tribos transformation of Escherichia coli JM109

Abstract

Transformation of microorganisms is a crucial task in molecular biology that still needs improvement. The traditional methods electroporation and heat shock do not always produce the desired transformants and new methods are mandatory for some wild type species that remain recalcitrant to traditional methods. Tribos transformation is a simple and low cost option that is based in spreading a suspension of microorganism/DNA/cellular membrane permeation substance on Petri dishes containing a gel and a nutrient source. The permeation substance can consist of nanoneedles such as chrysotile or sepiolite that pierce the membrane or a destabilizing agent such as aminoclays that promote rupture of the membrane and DNA entry into the cytoplasm. In this thesis we synthesized polydispersed nanoneedles and monodispersed nanoneedles of Fe3O4 that were used to transform Escherichia coli JM109 with transformation efficiencies of 4.20×102 CFU/μg pUC19 and 3.07×102 CFU/μg pUC19 respectively. The efficiencies are low compared to the ones normally obtained by heat shock or electroporation but produced dozens of colonies and the method can be used for molecular biology purposes such as cloning. We also used sepiolite for transforming E. coli JM109 with the plasmid pUC19 and optimized a protocol obtaining transformation efficiencies in the order of 4.1×104 CFU/μg pUC19. The agar content of Petri dishes was varied (1-4%), obtaining best results for 2% agar. The concentration of cells was also optimized (OD600=1.3 corresponding to 1.4×109 bacterial cells/ mL), and an automatic setup for spreading the sepiolite/E. coli/pUC19 dispersion was built providing more reliable results than manual spreading. The best concentration of sepiolite was also evaluated, producing best results for 0.01% sepiolite. The method proved to be suitable for a rapid and low cost transformation of non-competent E. coli JM109, where higher values of efficiency do not need to be attained. Finally, the tribos method was also tested using Mg aminoclays. The maximum average transformation efficiency attained was 7.0×103 CFU/μg pUC19 for 90 sec spreading time with a cell optical density of 1.3 (OD600=1.3). This value is inferior to the efficiency of transformation that can be attained with sepiolite but higher than with synthetic nanoneedles. There also is not needed any preparation of competent cells contrary to heat shock or electroporation, which becomes an advantage by making the procedure less time consuming.

Transformação de microorganismos é uma tarefa crucial em biologia molecular que ainda precisa de ser melhorada. Os métodos tradicionais de electroporação e choque térmico nem sempre produzem os transformandos desejados e novos métodos são essenciais para algumas espécies selvagens que se mantém recalcitrantes aos métodos tradicionais. A transformação pelo método de tribos é uma solução simples e de baixo custo que é baseada no espalhamento de uma suspensão de microorganismos/ADN/substância que permeia a membrana celular em placas de Petri contendo um gel e uma fonte de nutrientes. A substância de permeação pode consistir em nanoagulhas como crisolite ou sepiolite que permeiam a membrana ou um agente desestabilizador como aminoargilas que promovem a rutura da membrana e consequente entrada de ADN no citoplasma. Nesta tese foram sintetizadas nanoagulhas polidispersas e nanoagulhas monodispersas de Fe3O4 que foram usadas para a transformação de Escherichia coli JM109 obtendo-se eficiências de transformação de 4.20×102 CFU/μg pUC19 e 3.07×102 CFU/μg pUC19 respetivamente. As eficiências são baixas quando comparadas com as normalmente obtidas por choque térmico ou electroporação mas foram produzidas dúzias de colónias e o método pode ser utilizado em actividades de biologia molecular como por exemplo a clonagem. Também foi utilizada sepiolite para transformar E. coli JM109 com o plasmídeo pUC19 e foi otimizado um protocolo obtendo-se eficiências de transformação na ordem de 4.1×104 CFU/μg pUC19. O conteúdo de agar foi também variado (1-4%), obtendo-se os melhores resultados para 2% agar. A concentração de células também foi otimizada (OD600=1.3 correspondendo a 1.4×109 células bacterias/mL), e um dispositivo automático para o espalhamento da dispersão sepiolite/E. coli/pUC19 foi construído produzindo resultados mais fiáveis que o espalhamento manual. A melhor concentração de sepiolite também foi avaliada, produzindose os melhores resultados para 0.01 % sepiolite. O método provou ser adequado para uma rápida e de baixo custo transformação de E coli JM109 não competente, onde valores mais elevados de eficiência não necessitam de ser alcançados. Finalmente, o método de tribos foi também testado utilizando-se aminoargilas de Mg e pUC19. A eficiência de transformação alcançada foi de 7.0×103 CFU/μg pUC19 para um espalhamento de 90 s e densidade óptica de 1.3 (OD600=1.3). Este valor é inferior ao obtido com sepiolite mas superior ao obtido com nanoagulhas sintéticas. Também não é necessário a preparação de células competentes o que torna o processo mais rápido do que o choque térmico ou a electroporação.