Disclosing the catalytic mechanism of Xanthine Oxidase by computational means

Abstract

Xanthine and uric acid are two important intermediates in the nucleotide degradation pathway. However, there are some diseases associated with it, being the most common the deposition of uric acid in joints, causing lots of pain. To solve these problems, some inhibitors already exist to reduce the enzymatic activity of Xanthine Oxidase. However, in order to develop new and more efficient inhibitors targeting this enzyme, it is necessary to gather a better understanding about its catalytic mechanism. In this thesis, theoretical and computational means are used to unravel all the steps that are required for the oxidation of hypoxanthine to uric acid. To this end, QM/MM methodologies were applied having as reference the X-ray structure with the pdb code: 3AMZ. The QM part was calculated using DFT (B3LYP) with the 6-31G(d) basis set, whereas the MM part was considered under MM approach using GAFF and ff99SB force fields amongst other parameters determined by us. The new proposal for the catalytic mechanism of XO is composed by three main stages. The first one involves the coordination of xanthine to the Mo ion, the second one involves the release of uric acid and the third one the oxidation of the Moco, and subsequent enzymatic turnover. The first part consists in a nucleophilic attack from xanthine to the molybdenum cofactor, followed by a hydrogen atom transfer. The first step is endoenergonic (ΔrGstep1 = 7.5 kcal mol-1), whereas the hydrogen atom transfer is very exoenergetic (ΔrGstep2 = - 18.3 kcal mol-1), which turns the first stage of the mechanism an irreversible process. The second part involves the protonation of a reaction intermediate from which results uric acid and its consequent release. Both steps are exoenergetics (ΔrGstep3 = - 11.4 kcal mol-1 e ΔrGstep4 = -3.3 kcal mol-1). The third stage involves the oxidation of the Moco cofactor and the enzymatic turnover. This stage involves a rearrange of protons in the active site of the enzyme with the release of two electrons, followed by the water coordination to the molybdenum cofactor and, finally, the release of two-protons. The energy associated with this step is endoenergetic (ΔrG = 13.8 kcal mol-1) and it is the limiting step of the reaction (ΔG‡ = 14.2 kcal mol-1), which is close to the experimental one (ΔG‡ = 15.72 kcal mol-1). All the obtained results are consistent with the available experimental data that indicated that Glu802, Arg880 and Glu1261 play a key role in the reaction. This data can now be used to study other mechanism of the enzyme (for example the conversion of hypoxanthine in xanthine) and further be used to develop new drugs to treat uric acid related diseases. Additionally, the importance of computational means was consolidated one again, becoming a stronger approach to test and validate experimental data, as well as to provide new insights and new mechanistic proposals that were still not tested yet.

Xantina e ácido úrico são dois intermediários importantes na via catabólica de nucleótidos. No entanto, existem algumas doenças associadas a estes compostos, sendo uma das mais comuns a deposição de ácido úrico nas articulações. Para resolver estes problemas, foram desenvolvidos alguns inibidores que inibem a atividade enzimática da Xantina Oxidase. No entanto, este campo ainda requer muitos avanço científicos dado que o mecanismo catalítico desta enzima ainda é pouco conhecido, o que limita o desenvolvimento de novos fármacos capazes de inibir esta enzima e tratar este tipo de doenças. Neste trabalho foram utilizadas ferramentas computacionais para estudar o mecanismo catalítico da enzima xantina oxidase. Para este efeito foi construído um modelo da enzima baseado na estrutura cristalográfica com o código PDB 3AMZ. Este modelo foi depois submetido a cálculos teóricos e computacionais usando metodologias QM/MM. A parte QM foi calculada utilizando DFT (B3LYP) com a base de funções 6-31G(d), enquanto que, a parte MM foi calculada por métodos de MM utilizando GAFF e campos de força ff99SB entre outros parâmetros determinados por nós. O mecanismo determinado é constituído por três fases distintas. A primeira fase envolve a coordenação da xantina ao ião de molibdénio. A segunda fase a formação do ácido úrico e a sua libertação para o solvente. A terceira fase consiste na oxidação do centro ativo e subsequente regeneração da enzima. A primeira fase envolve dois passos sequenciais, onde ocorre a coordenação da xantina ao ião de molibdénio, e a passagem de um hidrogénio entro o cofactor e o intermediário da reação. O primeiro passo é endoenergónico (ΔrGpasso1 = 7.5 kcal mol-1), enquanto que o segundo passo é muito exoenergónico (ΔrGpasso2 = -18.3 kcal mol-1). O total dos dois passos torna esta primeira fase do mecanismo um processo irreversível. A segunda fase do mecanismo consiste na formação do ácido úrico e consequente libertação para o solvente. Ambos os passos são exoenergónicos (ΔrGpasso3 = -11.4 kcal mol-1 e ΔrGpasso4 = -3.3 kcal mol-1). A terceira fase do mecanismo envolve a regeneração da enzima. Esta fase iniciase com um rearranjo de protões no centro ativo do qual resulta a libertação de dois eletrões. De seguida ocorre a coordenação de uma molécula de água ao cofator de molibdénio e, finalmente, a libertação de dois protões. Esta reação é endoenergónica (ΔrG = 13.8 kcal mol-1) e a é o passo limitante da reação (ΔG‡ = 14.2 kcal mol-1), que é próximo do determinado experimentalmente (ΔG‡ = 15.72 kcal mol-1). Todos os resultados obtidos neste trabalho são consistentes com as informações experimentais disponíveis, tanto da cinética, como das mutações, validando resultados relativos ao Glu802, a Arg880 e o Glu1261, ao qual era atribuído um papel importante no mecanismo enzimático. Estas informações podem agora der usadas para estudar outros mecanismos desta enzima (como por exemplo a conversão de hipoxantina a xantina) e também o desenvolvimento de novos fármacos para tratar doenças relacionadas com o ácido úrico. Adicionalmente, a importância da utilização de métodos computacionais em bioquímica foi validada novamente, tornando-se uma forte metodologia para testar e validar informações experimentais, bem como para propor novas teorias que ainda não tenham sido testadas.