Innovative Ochratoxin A (OTA) extraction platforms using OTA-binding proteins

Abstract

Wine is a widely consumed product that is often associated with contaminations of toxic metabolites called mycotoxins. The most important mycotoxin associated to wine is ochratoxin A (OTA), and its detection usually involves the clean-up of samples with immunoaffinity columns (IAC) and quantification by HPLC coupled with fluorescence detection (FL). However, the several drawbacks associated with the use of the IAC led to the search for alternative clean-up methods. Thus, in this work, new platforms for OTA clean-up from wine were developed, based on proteins whose affinity towards OTA makes them suitable candidates to mimic the binding properties of the antibodies used in the IAC method. In a first approach, a protein with high affinity towards OTA, was used to develop a new solid phase extraction (SPE) method for the extraction of the mycotoxin from wine and subsequent quantification by HPLC-FL. The capture of OTA by the columns constructed with agarose-immobilized OTA binding protein was optimized to allow the full recovery of OTA in wine, and the method was further validated by the evaluation of various parameters such as recovery rates, selectivity and limits of detection (LOD) and quantification (LOQ). The developed method was selective enough for a reliable determination of OTA in wine, presenting recovery rates superior to 98% and LOD and LOQ of 0.02 and 0.05 μg L-1, respectively. Furthermore, the performance of the developed method revealed no significant differences in relation to the IAC method in concentrations up to 2 μg L-1 of OTA. In comparison with other conventional SPE methods reported in the literature, the developed method has proved to be suitable to be employed in the determination of OTA in wine. In a second approach, the domain where lies the primary binding site of OTA in the OTA-binding protein used in the first approach was evaluated as OTA ligand for developing OTA extraction platforms based on this domain. For that, the domain was recombinantly produced, fused to a 6xHis tag, with and without the thioredoxin (TrxA) solubility partner, in two E. coli strains, BL21 (DE3) and Origami 2 (DE3). Soluble proteins, with and without TrxA, were produced by both strains, but the Origami strain provided higher yields of production (18.7 and 23.4 mg per litre of culture, respectively). In addition, differences observed in the affinity of the proteins for the nickel resin in the purification suggested that the structures acquired by the recombinant proteins produced in each strain were different. Furthermore, the fact that fusion proteins were less prone to degradation suggested that TrxA contributed for their stability. Studies of fluorescence spectroscopy revealed that only the recombinant proteins produced by the Origami strain were capable of interacting with OTA, thus indicating that these proteins were functional. The ability of the proteins produced from this strain, with and without TrxA, immobilized in nickel via the 6xHis tag, to capture the mycotoxin in buffer solutions was evaluated. SPE columns constructed with the nickel-immobilized recombinant proteins did not show the ability to effectively capture OTA. On the other hand, incubation assays performed in eppendorfs allowed decreasing OTA in solution up to 54 and 63%, respectively for immobilized proteins, with and without TrxA. These results open perspectives for the development of OTA extraction platforms based on the recombinant domain of this OTA-binding protein with matrixes less expensive than the agarose used in the first approach by means of specific purification tags.

O vinho é um produto largamente consumido que está frequentemente associado a contaminações com metabolitos tóxicos denominados de micotoxinas. A micotoxina mais importante associada ao vinho é a ocratoxina A (OTA), e a sua deteção envolve normalmente um passo de concentração das amostras com colunas de imunoafinidade (IAC) e deteção por HPLC acoplada com deteção por fluorescência (FL). Contudo, as diversas desvantagens associadas ao uso das IAC levaram à procura de métodos de concentração alternativos. Assim, neste trabalho, foram desenvolvidas novas plataformas de concentração de OTA do vinho, baseadas no uso de proteínas cuja afinidade para a OTA as torna candidatos adequados para mimetizar as propriedades de ligação dos anticorpos usados no método IAC. Numa primeira abordagem, uma proteína com alta afinidade para a OTA foi usada para desenvolver um novo método de extração em fase solida (SPE) para extrair esta micotoxina do vinho e subsequente quantificação por HPLC-FL. A captura de OTA por colunas construídas com a proteína em estudo imobilizada em agarose foi otimizada de forma a permitir uma recuperação total da micotoxina presente no vinho, e o método foi posteriormente validado através da avaliação de parâmetros como taxas de recuperação, seletividade e limites de deteção (LOD) e quantificação (LOQ). O método desenvolvido foi suficientemente seletivo para permitir uma quantificação confiável de OTA no vinho, apresentando taxas de recuperação superiores a 98% e um LOD e LOQ de 0.02 e 0.05 μg L-1, respetivamente. Em adição, o desempenho do método desenvolvido não apresentou diferenças significativas em relação ao método das IAC em concentrações até 2 μg L-1 de OTA. Em comparação com outros métodos convencionais de SPE reportados na literatura, o método desenvolvido revelou ser adequado para aplicação na determinação de OTA no vinho. Numa segunda abordagem, o domínio da proteína usada na primeira abordagem que contém o principal local de ligação da micotoxina, foi avaliado como ligando da OTA para o desenvolvimento de plataformas de extração de OTA baseadas nesse domínio. Para isso, este foi produzido de forma recombinante, em fusão com um 6xHis tag, com e sem tiorredoxina (TrxA) como parceiro de solubilidade, em duas estirpes de E. coli, BL21 (DE3) e Origami 2 (DE3). O domínio proteico solúvel, com e sem TrxA, foi produzido por ambas as estirpes, mas a estirpe Origami obteve maiores rendimentos de produção (18.7 e 23.4 mg por litro de cultura, respetivamente). Em adição, as diferenças observadas na afinidade das proteínas para a resina de níquel na purificação sugeriram que as estruturas adquiridas pelas proteínas produzidas em cada estirpe eram diferentes. Além disso, o facto de que que as proteínas de fusão se mostraram menos suscetíveis a degradação sugere que a TrxA contribuiu para a sua estabilidade. Estudos de espectroscopia de fluorescência revelaram que apenas as proteínas recombinantes produzidas pela estirpe Origami foram capazes de interagir com a OTA, indicando assim que estas se encontravam funcionais. A capacidade das proteínas produzidas por esta estirpe, com e sem TrxA, imobilizadas em níquel a partir do 6xHis tag, para capturarem a micotoxina em soluções tampão foi avaliada. Colunas SPE construídas com estas proteínas recombinantes imobilizadas em níquel não mostraram a capacidade de capturar efetivamente a OTA. Por outro lado, os ensaios realizados em “eppendorfs” permitiram reduções de OTA em solução até 54 e 63%, respetivamente para as proteínas imobilizadas com e sem TrxA. Estes resultados abrem perspetivas para o desenvolvimento de plataformas de extração de OTA baseadas neste domínio da proteína estudada com matrizes menos caras que a agarose usada na primeira abordagem por meio de tags de purificação específicos.