Development of a fast phage-based tool for the detection of nosocomial bacteria

Abstract

Enterococcus spp. and Staphylococcus spp. are among the leading cause of nosocomial infections worldwide. The rapid and sensitive detection of these pathogenic strains is important for an effective and accurate treatment. Bacteriophage proteins or fragments such as the cell wall binding domains (CBD) of endolysins and the receptor binding proteins (RBPs) can be used as bio-recognition elements for bacterial detection. The natural affinity to the targeted bacterium and the highly resilience to environmental conditions are some of the advantages comparative with other biological elements. In this work, a RBP protein from an Enterococcus phage was identified through in silico analysis and cloned into a suitable vector and recombinantly expressed. The binding ability of this protein was assessed against the most commonly reported Enterococcus species in nosocomial infections, and the results indicate that the RBP is able to recognize 77 % of Enterococcus faecalis and 20 % of Enterococcus faecium strains tested, demonstrating its potential in Enterococcus detection. The simultaneous detection of different etiological agents of nosocomial infections can save considerable amount of time and resources. To performe a multiplex detection of nosocomial pathogens, the cloned Enterococcus RBP was used combined with a CBD protein from a Staphylococcus phage for the simultaneous detection of Enterococcus and Staphylococcus strains, respectively. The RBP and CBD were fused with a mCherry fluorescence protein and with a green fluorescence protein (GFP), respectively, and the multiplex analysis was performed by epifluorescence microscopy, flow cytometry and spectrofluorometry. The epifluorescence microscopy assays showed promising results for the simultaneous detection of both bacteria in horse blood samples demonstrating method potential for application in a clinical context. The results from the spectrofluorometry assays for the simultaneous detection of both bacteria in horse blood samples shown cross reactivity of the CBD, however this limitation can be overcome with an enrichment step that guarantee a minimum number of cells (108 CFU/mL) to be analyzed allowing differentiate the true positive and false positive signal. At last, the results of bacterial detection by flow cytometry displayed favorable results, however this method still needs to be optimized to understand its real potential for the simultaneous detection of both bacteria in clinical samples.

Enterococcus spp. e Staphylococcus spp. estão entre as principais causas de infeções nosocomiais no mundo. A deteção rápida e sensível destas estirpes patogénicas é importante para um tratamento preciso e eficaz. As proteínas de bacteriófagos ou fragmentos como o domínio de ligação da parede celular (CBDs) das endolisinas e as proteínas de ligação ao recetor (RBPs) podem ser utilizadas como elementos de bio reconhecimento para a deteção bacteriana. A afinidade natural para a bactéria alvo e a alta resiliência a condições ambientais são algumas das vantagens comparativamente a outros elementos biológicos. Neste trabalho, uma proteína RBP de um fago de Enterococcus foi identificada através da análise in silico, depois clonada num vetor apropriado e expressa por recombinação heteróloga. A habilidade de ligação desta proteína foi analisada em espécies de Enterococcus que são as principais causadoras de infeções nosocomiais, e os resultados indicam que a RBP ligou a 77 % das estirpes de Enterococcus faecalis testadas e a 20 % das estirpes de Enterococcus faecium testados, provando assim o seu potencial para ser utilizada para a deteção de Enterococcus. A deteção simultânea de diferentes patogénicos nosocomiais pode economizar consideravelmente o tempo e os recursos. Com o objetivo de realizar uma deteção em multiplex de patógenos nosocomiais, a Enterococcus RBP clonada foi usada em combinação com uma proteína CBD de um fago de Staphylococcus para a deteção simultânea de estirpes de Enterococcus e Staphylococcus, respetivamente. A RBP e a CBD foram fundidas com a proteína fluorescente mCherry e com a proteína fluorescente verde (GFP), respetivamente, e as amostras foram analisadas por microscopia de epifluorescência, citometria de fluxo e espectrofluorimetria. A microscopia de epifluorescência mostrou resultados muito promissores para a deteção simultânea das duas bacterias em tampão e em sangue, provando grande potencial para a aplicação em contexto clínico. Os resultados do espectrofluorimetro para a deteção simultânea de ambas as bacterias nas amostras de sangue de cavalo mostrou reatividade cruzada do CBD, no entanto esta limitação pode ser ultrapassada com um passo de enriquecimento que permita garantir um número mínimo de células (108 CFU/mL) a ser analisadas permitindo diferenciar o sinal positivo verdadeiro do falso. Por último, os resultados da deteção bacteriana por citometria de fluxo mostraram resultados promissores, no entanto este método precisa de mais otimizações para perceber o verdadeiro potencial da deteção em multiplex das bactérias em amostras clínicas.