Dextrin injectable hydrogel for tissue healing and regeneration

Abstract

The worldwide incidence of bone disorders is increasing, mainly due to ageing population. The lack of effective treatments stimulates the development of novel synthetic bone substitutes (SBSs). Ceramic based-SBSs commercially available display poor handling properties. Attempting to overcome this shortcoming improving the acceptance of these formulations, granular ceramics have been associated with hydrogels. Hydrogels, particularly, in situ gelling hydrogels, allow the production of injectable formulations which may be administrated using minimally invasive procedures, able of perfect fitting to the irregularities of bone tissue defects. Moreover, hydrogels mimic the native extracellular matrix and can act as cell/drug delivery systems. Dextrin is a low-molecular-weight carbohydrate obtained from starch. It is a low cost, broadly available raw material widely used in many industrial applications, such as adhesives in the manufacture of gummed tapes, textiles and paper, as moisturiser in cosmetics. However, as yet it is quite unexplored in the biomedical field. An injectable and in situ gelation hydrogel based on dextrin (HG) was developed aiming to act as a multifuctional, biocompatible and injectable matrix able to carry and stabilize other materials and/or cells in medical procedures. To obtain the HG, dextrin was firstly oxidized with sodium periodate and then cross-linked with adipic acid dihydrazide (ADH). In order to demonstrate the biocompatibility and safety and of the newly produced hydrogel, a combination of in vitro and in vivo tests, many of them in compliance with international standard guidelines (ISO and OECD), were performed. Thus, this work aimed to assess the biocompatibility and safety of the HG for clinical utilization and its ability to act as a carrier and stabilizer for Bonelike® (BL) granules, a SBS produced by Bioskin, SA, in order to obtain a formulation with improved handling properties, such as mouldability and injectability, and bioactivity. Since the HG is intended for usage as a vehicle for medical application, a sterilization protocol for oxidized dextrin (ODEX) by gamma irradiation was investigated. The potential structural changes of the material were analysed using mass spectrometry-based techniques. The results showed that gamma irradiation did not promote changes on the chemical structure of ODEX and can be used as suitable terminal sterilization method for ODEX. In vitro cytotoxicity assays performed in human lymphoblastoid TK6 cells revealed that HG display concentration dependent cytotoxicity, which was assigned to ODEX. The genotoxic potential of the HG and its isolated components (ODEX and ADH) were assessed in eukaryotic and prokaryotic cells. The results revealed that HG, as well as ODEX and ADH, did not induce DNA or chromosomal damage. The in vivo biocompatibility and safety of the HG was further assessed by subacute systemic toxicity and skin sensitization tests, using rodent models. The results showed that the HG did not induce any systemic toxic effect, DNA damage in blood cells or skin reactions, neither impaired the natural bone repair/regeneration process. Then, the HG was successfully combined with BL granules (250-500 μm) to obtain a mouldable/injectable SBS and was implanted in two different bone defects: critical-sized calvarial defect (14 mm) and tibial fractures (4 mm) in goats. The results showed that HG allowed the stabilization of the granules into the defect, ensuring effective handling and moulding properties of the formulation and without affecting Bonelike® granules’ osteoconductive properties neither impairing the bone repair/regeneration process. Peptides obtained by hydrolysis of extracellular matrix from small intestinal submucosa (SIS), LLKKK18, a pro-angiogenic peptide, and human mesenchymal stem cells (hMSCs) from umbilical cord were also combined with the HG and BL granules to improve the bioactivity of the formulations.

A incidência de doenças/problemas ósseos tem aumentado mundialmente, principalmente devido ao envelhecimento da população. A falta de tratamentos eficazes tem impulsionado o desenvolvimento de novos substitutos ósseos sintéticos (SBSs). Os SBSs à base de cerâmicos comercialmente disponíveis apresentam limitações ao seu manuseamento. Por forma a contornar essa limitação e melhorar a aceitação clínica dessas formulações, os cerâmicos granulares têm sido associados a hidrogéis. Os hidrogéis, nomeadamente, aqueles que gelificam in situ, permitem a obtenção de formulações injetáveis capazes de alcançar áreas do corpo menos acessíveis, utilizando, para tal, procedimentos minimamente invasivos, e de preencherem perfeitamente os defeitos ósseo, que geralmente são irregulares. Além disso, os hidrogéis mimetizam a matriz extracelular e podem atuar como sistemas de entrega de células/ fármacos. O dextrino é um carboidrato de baixo peso molecular obtido a partir do amido. É uma matéria-prima de baixo custo, amplamente disponível e utilizada em variadas aplicações industriais, como adesivos na produção de fitas gomadas, têxteis e papel, e como agente hidratante em cosméticos. Contudo, é ainda pouco explorado na área biomédica. Em trabalho anterior desenvolvido no nosso grupo de investigação, foi desenvolvido um hidrogel de dextrino injetável e capaz de gelificar in situ com o intuito de ser uma matriz multifuncional, biocompatível e injetável capaz de transportar e estabilizar outros materiais e/ou células em procedimentos médicos. Para a produção do HG, o dextrino foi primeiramente oxidado com periodato de sódio e posteriormente reticulado com di-hidrazida de ácido adípico (ADH). A fim de demonstrar a biocompatibilidade e segurança do HG, foram neste trabalho realizados um conjunto de testes in vitro e in vivo, muitos deles em conformidade com as diretrizes internacionais (ISO e OECD). Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar a biocompatibilidade e a segurança do HG para uso clínico e a sua aptidão como veículo e estabilizante dos grânulos de Bonelike® (BL), um SBS produzido pela Bioskin, SA, a fim de obter uma formulação com melhores propriedades de manuseamento, nomeadamente moldagem e injetabilidade, bem como bioatividade. Dado que o HG foi concebido para uso clínico, foi testado e analisado um protocolo de esterilização para o dextrino oxidado (ODEX), usando a irradiação gama. As potenciais mudanças estruturais do material foram analisadas recorrendo a técnicas baseadas em espectrometria de massa. Os resultados mostraram que a irradiação gama não promoveu mudanças na estrutura química da ODEX e que pode ser usada como método de esterilização terminal seguro para o ODEX. Foram efetuados testes de citotoxicidade in vitro em células linfoblásticas humanas, TK6, que revelaram que o HG apresenta uma citotoxicidade dependente da concentração causada pelo ODEX. O potencial genotóxico do HG e dos seus constituintes (ODEX e ADH) foi avaliado em células eucarióticas e procarióticas. Os resultados mostraram que o HG, bem como o ODEX e o ADH, não induziram danos genéticos ou cromossómicos. A segurança e a biocompatibilidade in vivo do HG foram avaliadas pelos testes de toxicidade sistémica subaguda e de sensibilização cutânea, usando modelos de roedores. Os resultados mostraram que o HG não induziu nenhum efeito sistémico tóxico, dano genético nas células do sangue ou reações cutâneas, nem prejudicou o processo natural de reparação/regeneração óssea. O HG foi depois combinado, com sucesso, com os grânulos de BL (250-500 μm) para a obtenção um SBS moldável/injetável, que foi implantado em dois tipos de defeitos ósseos: defeitos críticos da calvária (14 mm) e fraturas da tíbia (4 mm), em cabras. Os resultados mostraram que o HG permitiu a estabilização dos grânulos no defeito, garantindo um manuseamento/moldagem fácil da formulação, sem, contudo, afetar as propriedades osteocondutoras do Bonelike®, nem inibiu o processo de regeneração óssea. Os péptidos resultantes da degradação enzimática da matriz extracelular do intestino, o péptido pró-angiogénico LLKKK18 e as células estaminais do cordão umbilical também foram associadas ao hidrogel e BL com o intuito de melhorar a bioatividade das formulações.