Estudo de fermentações com co-culturas aplicadas a matrizes alimentares

Abstract

Os processos fermentativos realizados por microrganismos são amplamente utilizados na produção industrial de vários produtos e compostos. Existem vários processos nos quais a atividade simultânea de duas ou mais espécies de microrganismos (co-culturas) num ambiente controlado é de elevada importância para o produto final. Nestes casos, os compostos produzidos em co-cultura são diferentes daqueles produzidos em culturas puras de todos os microrganismos presentes, o que tem impacto nas propriedades sensoriais do produto final. O presente trabalho visa o estudo de co-culturas de Saccharomyces cerevisiae e Dekkera bruxellensis aplicadas no envelhecimento e acidificação acelerados de cerveja. Pretende-se conhecer a dinâmica de co-culturas, tanto a nível do crescimento microbiano das estirpes envolvidas, como ao nível da produção de metabolitos, descrevendo as interações entre as diferentes estirpes em co-cultura, sejam elas neutras, sinérgicas ou competitivas. Para tal, realizaram-se 8 ensaios fermentativos diferentes em condições de cultura pura e co-cultura, 5 dos quais para analisar o impacto no processo fermentativo da alteração da taxa de inóculo, elevada concentração de glicose, temperatura, e de etanol, e os restantes 3 foram aplicados a matrizes alimentares. Os ensaios foram acompanhados de análise dos perfis de crescimento por citometria de fluxo, perfis de produção de metabolitos maioritários por HPLC e análise de metabolitos secundários por GC-MS. Observou-se que S. cerevisiae e D. bruxellensis apresentam uma relação competitiva, sendo que em co-cultura em meio ideal, S. cerevisiae consome glicose mais rapidamente e apresenta um crescimento bastante superior a D. bruxellensis, sendo o mesmo verificado para elevadas concentrações de açúcar. Já D. bruxellensis consegue um crescimento exponencialmente superior em situação de aumento da taxa de inóculo relativamente a S. cerevisiae, sendo que na situação contrária há um equilíbrio das populações. Verificou-se ainda uma morte celular precoce por parte de ambas as leveduras com a diminuição da temperatura para 21 ℃. D. bruxellensis apresenta maior resistência ao etanol e aos compostos extraídos da madeira de barrica, demonstrando uma tolerância ao etanol até concentrações de 8-10 %. Relativamente aos compostos secundários, verifica-se essencialmente a produção de ésteres, álcoois e ácidos orgânicos pelas leveduras, mas apenas D. bruxellensis é responsável pela produção dos etilfenóis 4-etilguaicol e 4-etilfenol, apresentado as maiores concentrações destes metabolitos nos ensaios de refermentação de produtos cervejeiros acabados.

Fermentative processes performed by microorganisms are widely used in several compound’s industrial production. There are currently several food processes in which the simultaneous activity of two or more microorganisms (co-cultures), in a controlled manner, is crucial for the end product. In these cases, the compounds produced in co-culture are different from those produced in pure cultures of different microorganism populations, which will have an impact on the sensory characteristics of the final product. This project aims to study co-cultures of Saccharomyces cerevisiae and Dekkera bruxellensis applied to accelerated ageing and souring of beer. It is intended to understand the dynamic of co-cultures, both in the growth rate of all the species involved as well as the profile of metabolites produced, and to describe the existent interactions between them, whether neutral, synergic or competitive. This knowledge is to be accompanied by a compilation of analysis’ methodologies usually used in the study of co-culture fermentations´ dynamics. With this purpose in mind, 8 fermentation tests were assayed, 5 of which were conducted in synthetic medium intended to show the impact of different pitching rates, high glucose concentration, temperature and ethanol in the fermentation process, and the last 3 were applied to real matrices. The different assays were analyzed by flow cytometry to determine the growth profile, HPLC to determine the profile of production of primary metabolites and GC-MS to determine the secondary metabolite profile. It was concluded that S. cerevisiae and D. bruxellensis compete for glucose, being that in synthetic co-culture medium, S. cerevisiae consumes glucose and grows much faster than D. bruxellensis, even in high glucose media. D. bruxellensis outcompetes S. cerevisiae when in superior cell concentration at the start of the fermentation. On the other hand, when a bigger pitching rate benefits S. cerevisiae an equilibrium is reached between both populations. It was also verified early cell death by both yeast when there was a decrease in temperature to 21℃. D. bruxellensis shows greater tolerance to wood compounds and ethanol, demonstrating growth up to 8-10 % ethanol in extraction medium. Regarding secondary compounds, it was verified the production of mainly esters, alcohols and organic acids by both yeasts, but only D. bruxellensis shows production capability of ehtylphenol compounds such as 4-ethylguaicol and 4-ethylphenol, showing higher production in the refermentation of beer products.