Glycanzyme: characterisation of novel enzymes for protein glycoengineering

Abstract

One of the most common protein post-translational modifications occurring in eukaryotes is glycosylation, which is critical for several biological processes. There are different enzymes involved in the processing of N-glycans in eukaryotes, among them endo-β-N-acetylglucosaminidases (ENGases), whose physiological roles are still poorly understood. ENGases of the glycoside hydrolase (GH) family 85 are a class of enzymes (EC 3.2.1.96) that, in addition to hydrolytic activity against the diacetylchitobiose core of N-glycans, can also display transglycosylation activity. Given their usefulness for the analysis and glycoengineering of glycopeptides and glycoproteins, these enzymes have become a focus of biotechnological interest. Envisioning the identification of novel GH85 ENGases with useful action, this thesis focused on the characterization of two new putative ENGases of this family, one from the filamentous fungus Ashbya gossypii (AgENGase) and another from the yeast Zygosaccharomyces rouxii (ZrENGase). Previous experimental results hinted at the existence of ENGase activity in these organisms and in their genome one homologue gene exists that should code for a putative GH85 ENGase (AFR597W in A. gossypii and ZYRO0B07216g in Z. rouxii). Bioinformatic approaches were initially used to assess the potential activity of these putative ENGases and important residues for the hydrolytic and transglycosylation activity were found to be conserved in AgENGase. Only the putative 3D model of ZrENGase presented the typical (β8/α8)-TIM-barrel structure of ENGases. To characterise these proteins, their coding genes were cloned into an Escherichia coli expression plasmid and their recombinant production was optimized by testing different E. coli expression strains, production media and induction conditions. However, the recombinant proteins produced remained mainly in the insoluble fraction after cell lysis and further improvements in their production and purification will be required to generate enough protein for activity studies and eventual application. Nevertheless, different protocols were already optimized in the scope of this thesis for the future evaluation of the deglycosylation activity of these recombinant ENGases. Considering the bioinformatic analysis and the results from enzymatic assays performed in crude cell extracts of wild A. gossypii, the AgENGase action could be located in the intracellular space. Envisioning the understanding of the physiological role of the putative AgENGase, a gene with no homolog in Saccharomyces cerevisiae and with unknown function, the disruption of the A. gossypii AFR597W was also performed. Thereby, AgENGase was found to be important for sporulation, as the generated afr597w mutants lost the ability to sporulate. Nevertheless, further studies will be needed to fully understand the physiological and enzymatic function of this enzyme.

Uma das modificações pós-tradução de proteínas mais comuns que ocorrem em eucariotas é a glicosilação, que é crítica para vários processos biológicos. Existem diferentes enzimas envolvidas no processamento de N-glicanos em eucariotas, entre elas as endo-β-N-acetilglucosaminidases (ENGases), cujos papéis fisiológicos ainda são pouco compreendidos. ENGases da família glicosil hidrolase (GH) 85 são uma classe de enzimas (EC 3.2.1.96) que, além da atividade hidrolítica no núcleo de diacetilquitobiose de N-glicanos, também podem exibir atividade de transglicosilação. Dada a sua utilidade para a análise e a glico-engenharia de glicopéptidos e glicoproteínas, essas enzimas apresentam-se com forte interesse biotecnológico. Tendo em vista a identificação de novas ENGases da família GH85 de interesse, esta tese focou a caracterização de duas novas supostas ENGases dessa família, uma do fungo filamentoso Ashbya gossypii (AgENGase) e outra da levedura Zygosaccharomyces rouxii (ZrENGase). Resultados experimentais anteriores sugeriram a existência de atividade ENGase nesses organismos e, no seu genoma, encontrou-se um gene homólogo que poderá codificar para putativas ENGases da família GH85 (AFR597W em A. gossypii e ZYRO0B07216g em Z. rouxii). Abordagens bioinformáticas foram usadas inicialmente para avaliar a atividade potencial dessas ENGases e foram identificados resíduos importantes para a atividade hidrolítica e de transglicosilação conservados na putativa AgENGase. Por outro lado, apenas o suposto modelo 3D previsto para a putativa ZrENGase apresentou a estrutura típica de um barril TIM (β8/α8) das ENGases. Para caracterizar essas proteínas, os seus genes foram clonados num plasmídeo de expressão de Escherichia coli e a sua produção recombinante foi otimizada testando diferentes estirpes de expressão de E. coli, meios de produção e condições de indução. No entanto, as proteínas recombinantes produzidas permaneceram principalmente na fração insolúvel após a lise celular e serão necessárias melhorias adicionais na sua produção e purificação para gerar quantidade de proteína suficiente para estudos de atividade e eventuais aplicações. No entanto, diferentes protocolos já foram otimizados no âmbito desta tese para avaliação futura da atividade de desglicosilação dessas ENGases recombinantes. Considerando a análise bioinformática e os resultados de ensaios enzimáticos realizados em extratos celulares brutos de A. gossypii wild, foi possível determinar a localização da AgENGase como sendo intracelular. Visando compreender o papel fisiológico da suposta AgENGase foi também realizada a interrupção do gene AFR597W de A. gossypii. Dessa forma, a AgENGase foi considerada importante para a esporulação, pois os mutantes afr597w gerados perderam a capacidade de esporular. No entanto, serão necessários mais estudos para entender completamente a função fisiológica e enzimática dessa enzima.