Functional expression of transporters in yeast

Abstract

The growing scientific knowledge about microorganisms enabled the development of improved strains currently used in different biotechnological industries. In the specific case of the biorefinery, microorganisms, e.g. Saccharomyces cerevisiae, are used to convert biomass (sugars) in building blocks (lactic acid) and in bioethanol. S. cerevisiae’s inability to assimilate and metabolize xylose, one of the most predominant sugars in biomass, limits its role in the biorefinery fermentation process. The development of an engineered S. cerevisiae strain able to efficiently transport xylose, will increase the productivity levels of bioethanol, making this industry more cost effective. Furthermore, in biorefinery, microorganisms are used to produce building blocks, such as lactic acid. The use of an S. cerevisiae strain capable of fermenting sugars from biomass in lactic acid, and capable of exporting this acid, will increase the amount of lactic acid produced. In this work two lactate transporters (lactate transporter I and lactate transporter II) and two xylose transporters (xylose transporter I and xylose transporter II) were cloned and expressed in S. cerevisiae strains, in order to characterize them as functional transporters. Cells expressing these transporters recovered the ability to grow in lactic acid as sole carbon and energy source. Transporters GFP tagged were expressed at the plasma membrane. Cells expressing the lactate transporters I and II revealed the existence of a mediated transport system for lactic acid, with specificity for other monocarboxylic acids, such as acetic, formic and pyruvic acid. Regarding the xylose transporters tested, cells expressing these transporters were not able to recover the ability to grow neither on xylose nor in glucose. This could be due to the inefficient expression of the transporters, since the proteins tagged with GFP were not located at the plasma membrane. However, these results do not exclude the xylose transporters as functional in S. cerevisiae. Further experiments are necessary, such expressing xylose transporters in a S. cerevisiae strain able to metabolize xylose. Overall, the transporters tested in this work are functional transporters in S. cerevisiae. This promising results could be indicative of the possibility of using these lactate and xylose transporters in yeasts, with biotechnological applications in biorefinery.

O crescente conhecimento científico tem conduzido ao desenvolvimento de estirpes capazes de melhorar vários processos biotecnológicos. Microorganismos, como por exemplo a Saccharomyces cerevisiae, são usados em biorrefinaria para a conversão de biomassa (açúcares) em percursores de moléculas de interesse (ácido láctico) e em bioetanol. A levedura S. cerevisiae não é capaz de assimilar nem de metabolizar xilose, um dos açúcares mais abundantes na biomassa. O desenvolvimento de uma estirpe de S. cerevisiae com a capacidade de transportar eficientemente xilose, irá aumentar os níveis de produtividade de bioetanol e tornar esta indústria mais atrativa a nível económico. Para além da produção de bioetanol, em biorrefineria os microorganismos são utilizados para a produção de percursores de moléculas de interesse, como o ácido láctico. O uso de uma estirpe de S. cerevisiae capaz de fermentar açúcares em ácido láctico e posteriormente, de exportar este ácido, irá aumentar o rendimento do processo fermentativo. Neste trabalho dois transportadores de ácido láctico (transportador de lactato I e o transportador de lactato II) e dois transportadores de xilose (transportador de xilose I e o transportador de xilose II) foram clonados e expressos em estirpes de S. cerevisiae e foi avaliada a sua funcionalidade na levedura. As células de S. cerevisiae que expressaram estes transportadores recuperaram o seu crescimento em ácido láctico. Os transportadores marcados com GFP foram expressos na membrana plasmática. As células que expressaram estes transportadores revelaram um transporte mediado para o ácido láctico, bem como especificidade para outros ácidos monocarboxílicos, como o ácido acético, fórmico e pirúvico. Relativamente aos transportadores de xilose testados, as células de S. cerevisiae não recuperaram a sua capacidade de crescer em xilose, nem em glucose. Esta observação pode estar associada à expressão pouco eficiente dos transportadores, visto que a proteína marcada com GFP não foi localizada na membrana plasmática. No futuro será necessário expressar os transportadores de xilose numa estirpe de S. cerevisiae capaz de metabolizar esta pentose. Em resumo, os transportadores testados revelaram-se funcionais em S. cerevisiae. Os resultados demonstraram ser promissores para o uso dos transportadores de lactato e de xilose em levedura, no âmbito da biorrefinaria.