Screening of single cell oils producing yeasts using volatile fatty acids as carbon sources: optimisation of Fourier transform infrared spectroscopy as a method to study lipid accumulation

Abstract

Oleaginous yeasts are considered the most competent microorganisms for the synthesis of single cell oils (SCOs), owing to their short life cycles and high growth rates, their extraordinary capacity to convert a variety of substrates, and also the possession of a metabolic system adequate for lipid synthesis. Even though SCOs production can represent a potential solution for the bio-based economy, its profitability is still questionable due to the high prices of traditional carbon sources used. As a consequence, efforts have been directed to reduce the costs and find potential alternative carbon sources, as volatile fatty acids resultant from organic waste treatment to cultivate oleaginous yeasts for SCOs production. In the present study, a high-throughput screening comprising 366 distinct isolates was performed by applying an optimised protocol based on two innovative approaches: (I) yeast cultivation in solid medium using acetic acid 15 g/L as carbon source, instead of aqueous one; (II) neutral lipid estimation by fluorimetry using the lipophilic dye Nile red. A good correlation between the fluorescence values of samples, estimated by fluorimetry, and the lipid content of yeast cells, determined by the gravimetric method (R2 = 0.923), was observed. The screening allowed the identification of six new yeast species as oleaginous, not yet reported in the literature, as well as the discovery of two promising oleaginous candidates for SCOs production, Apiotrichum brassicae and Pichia kudriavzevii. These species accumulated over 60% of their dry cell weight in lipids and were able to efficiently use acetic acid as carbon source. Another major result was the association of the oleaginous yeast character to the strain level, contrarily to the species-level linkage, as usually stated. Six yeast strains were further used to optimise a protocol using Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) in order to evaluate and monitor lipid accumulation in yeasts. This optimisation showed that the spectral variations observed in FTIR approach were correlated with the previous results obtained by gravimetry and fluorimetry. The results suggest this non-invasive and label-free technique as a reliable and high-throughput screening method to rapidly discriminate the oleaginous yeast potential. In conclusion, this work showed that fluorescence and spectroscopic approaches present many advantages for screening a high number of oleaginous yeasts.

As leveduras oleaginosas são consideradas os microrganismos mais competentes para a síntese de gotículas lipídicas (GL), graças aos seus curtos ciclos de vida e elevadas taxas de crescimento, às suas capacidades para utilizar vários substratos, mas também pelo facto de possuírem um sistema metabólico próprio para a síntese de lípidos. Ainda que a produção de GL possa representar uma solução viável para a bio economia, a sua rentabilidade é ainda discutível, devido ao elevado preço das fontes de carbono tradicionalmente usadas. Deste modo, vários esforços têm sido feitos no sentido de reduzir os custos, e encontrar fontes de carbono alternativas, como ácidos gordos voláteis no cultivo de leveduras oleaginosas para a produção de GL. O presente estudo visou a realização de um screening de alto débito compreendendo 366 isolados de leveduras, e aplicando um protocolo otimizado baseado em duas abordagens inovadoras: (I) crescimento das leveduras em meio sólido usando 15 g/L de ácido acético como fonte de carbono, contrariamente ao uso do meio líquido; (II) determinação dos lípidos neutros por fluorimetria recorrendo ao corante lipofílico Nile red. Uma boa correlação foi observada entre os valores de fluorescência, estimados por fluorimetria, e o teor de lípidos das leveduras, determinado pelo método gravimétrico (R2= 0.923). O screening permitiu identificar seis novas espécies de leveduras oleaginosas, nunca antes descritas, mas também a descoberta de duas leveduras promissoras para a produção de GL, Apiotrichum brassicae e Pichia kudriavzevii. Estas espécies acumularam mais de 60% do seu peso seco em lípidos, e utilizaram eficientemente o ácido acético. Foi também associado o carácter oleaginoso das leveduras ao nível da estirpe, contrariamente à associação ao nível da espécie frequentemente descrita. Seis estirpes de leveduras foram seguidamente utilizadas para otimizar um protocolo usando Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), a fim de avaliar e monitorizar a acumulação de lípidos em leveduras. As variações espectrais observadas foram correlacionadas com os resultados obtidos por fluorimetria e gravimetria. Os resultados sugerem esta técnica não invasiva e independente do uso de corantes como uma metodologia fiável e de alto débito para uma discriminação rápida do potencial de leveduras oleaginosas. Em conclusão, este trabalho mostrou que o uso da fluorescência e da espectroscopia apresenta várias vantagens para a realização de um screening de elevado número de leveduras oleaginosas.