Biological insights from the whole genome resequencing of grapevine germplasm

Abstract

Plant germplasm is a valuable natural resource, with significant applications both in fundamental science and in biotechnology. The in-depth characterization of such resources is indispensable to modern day biology, as it tries to understand the molecular basis underpinning important crop traits. The deeper the knowledge on germplasm diversity, the vaster the number of tools available to improve the way by which humans interact with plants. A trend in the last few hundred years is the loss of genetic diversity driven by an intensive selection of cultivars that provide more, while requiring less resources and care. Similar genetic erosion has been a key feature of grapevine (Vitis vinifera L.), one of the most significant crops in the world. Presently, it is acknowledged that conservation and characterization of the existing genetic diversity of local varieties is a priority. The research group at CIBIO has been addressing grapevine biology using next-generation sequencing (NGS) and whole genome re-sequencing strategies. The main objective of this project was to use NGS and bioinformatics skills to generate a deeper understanding of evolutionary relationships between grapevine cultivars, based on a pre-existing dataset of 100 genomes, re-sequenced at medium-to-low sequencing depth. The framework for this work was the implementation of probabilistic methods that account for nucleotide uncertainty, and make accurate inferences from low coverage data. Samples included several Vitis species plus a collection of wild and domesticated grapevine genotypes. Subsequent PCA analysis resolved the different species and separated wild from domesticated grapevine. It also allowed the establishment of six core populations within grapevine samples, which included two wild, one table and three wine grapevine populations. These populations were characterized across the genome, for a series of statistics associated with nucleotide diversity and presence of selection signatures. A clear decrease in nucleotide diversity was observed between East and West wild grapevine populations, a reduction that was also observed between wild and domesticated grapevine populations, though domesticated grapevine still maintained high levels of diversity. Results were consistent with an origin of domestication for grapevine in the Near East, but also substantiate a tentative introgression from wild grapevine into European wine varieties. We then used a novel statistic called De-correlated composite of multiple signals (DCMS), to combine four previously computed statistics for detection of selection signatures. As a case study, we addressed selection from wild genotypes expanding form their speciation center (East) to the edge of the expansion range (West). From these scores, we extracted the percentile 95% genomic regions, and analyzed its genes for annotation and Gene Ontology (GO) term enrichment. A lot of genes were associated with abiotic and biotic stress, programmed cell death, drought resistance, calcium signaling, sterol metabolism and reactive oxygen species (ROS) homeostasis. The highest ranking DCMS score proved to contain a relevant gene of interest, in the form of a resistance gene containing an NB-ARC domain, putatively involved in the response to pathogen infection. Collectively, results suggest that wild grapevine migration westward across Europe involved selection of genes strongly associated with encountering new pathogens and adapting to new environments. The workflow developed in the present thesis proved to be reliable to detect population genetic events, and the generated scripts helped accelerate the bioinformatics process to compute statistics such as DXY, plot better graphs to empower the analysis, and quickly find genes within positions of interest across the genome. Results provide strong new insight into grapevine domestication history, and the bioinformatics tools can be further applied to new comparisons, geared towards uncovering the genes underlying selection signatures across the grapevine genome.

O germoplasma vegetal é um recurso natural valioso, com aplicações significativas quer em biologia fundamental, quer em biotecnologia. A caracterização profunda de tais recursos é indispensável para a biologia moderna, na medida em que tenta entender a base molecular subjacente a importantes características das culturas. Quanto mais profundo o conhecimento sobre a diversidade do germoplasma, maior o número de ferramentas disponíveis para melhorar a forma como os humanos interagem com as plantas. Uma tendência nos últimos cem anos tem sido a perda de diversidade genética, impulsionada por uma seleção intensiva de culturas mais produtivas, ao mesmo tempo que exigem menos recursos e cuidados. Semelhante erosão genética tem sido observada na videira (Vitis vinifera L.), uma das culturas mais importantes do mundo. Atualmente, reconhece-se que a conservação e caracterização da diversidade genética de variedades locais é uma prioridade. O grupo de pesquisa do CIBIO tem vindo a abordar a biologia da videira usando Next Generation Sequencing (NGS) e estratégias de re-sequenciação do genoma. O principal objetivo deste projeto foi usar as possibilidades do NGS e da bioinformática para gerar um conhecimento mais detalhado das relações evolutivas entre variedades de videira, com base num conjunto de dados pré-existente de 100 genomas, re-sequenciados com uma cobertura de sequenciação média a baixa. Na base deste trabalho esteve a implementação de métodos probabilísticos que têm em conta a incerteza da atribuição de nucleótidos e fazem inferências precisas a partir de dados de baixa cobertura. As amostras incluíram várias espécies de Vitis e uma coleção de genótipos de videira selvagem e domesticada. A análise subsequente do PCA resolveu as diferentes espécies e separou a selvagem da videira domesticada. Também permitiu o estabelecimento de seis populações principais dentro de amostras de videira, que incluíam duas populações selvagens, uma de mesa e três de vinho. Essas populações foram caracterizadas em todo o genoma, recorrendo a uma série de estatísticas associadas à diversidade de nucleótidos e à presença de assinaturas de seleção. Foi observada uma clara diminuição na diversidade de nucleótidos entre as populações de videira selvagem de Leste e Oeste, uma redução que também foi observada entre populações de videiras selvagens e domesticadas, embora a videira domesticada ainda mantivesse altos níveis de diversidade. Os resultados foram consistentes com a origem da domesticação da videira no Oriente, mas também substanciam uma putativa introgressão secundária da videira selvagem nas variedades de vinho europeias. Em seguida, usámos uma estatística recente chamada De-correlated composite of multiple signals (DCMS), para combinar quatro estatísticas para a detecção de assinaturas de seleção. Como caso de estudo, abordámos a seleção de genótipos selvagens ao se expandirem do seu centro de especiação (Leste) até à borda do intervalo de expansão (Oeste). A partir desses valores de DCMS, extraímos as regiões genómicas do percentil 0,95 e analisámos os seus genes para anotação e enriquecimento de termos Gene Ontology (GO). Muitos genes estavam associados a stresse abiótico e biótico, morte celular programada, resistência à secura, sinalização de cálcio, metabolismo de esteróis e homeostasia de espécies reactivas de oxigénio (ROS). A pontuação mais elevada do DCMS provou conter um putativo gene de interesse, um gene de resistência contendo um domínio NB-ARC, possivelmente envolvido na resposta à infecção por patogénicos. Colectivamente, os resultados sugerem que a migração da videira selvagem para o Oeste da Europa envolveu a selecção de genes fortemente associados ao encontro de novos patogénicos e à adaptação a novos ambientes. O fluxo de trabalho desenvolvido nesta tese provou ser fiável para detectar eventos genéticos populacionais, os scripts gerados ajudaram a acelerar o processo bioinformático para calcular estatísticas como DXY, traçar gráficos melhores para favorecer a análise e rapidamente encontrar genes em posições de interesse no genoma. Os resultados apresentam uma nova visão sobre a história da domesticação da videira e as ferramentas de bioinformática podem ser aplicadas a novas comparações, dirigidas para a análise dos genes subjacentes às assinaturas de seleção no genoma da videira.