Virulence aspects of Staphylococcus epidermidis: biofilm formations and Poly-N-Acetyl-Glucosamine production

Abstract

Staphylococcus epidermidis and other Staphylococci are now well established as major nosocomial pathogens associated with infections of indwelling medical devices. The major virulence factor of these organisms is their ability to adhere to devices and form biofilms. Biofilms are complex microbial communities wherein bacteria acquire different characteristics from their planktonic counterparts, like enhanced resistance to antibiotics and host defenses. The work described in this thesis aimed at evaluating the ability of adhesion and biofilm formation of several clinical isolates of Staphylococci as well as the phenotypic alterations triggered by the sessile mode of growth. The determination of the role of Poly-N-Acetyl-Glucosamine (PNAG), a major constituent of the biofilm matrix, in S. epidermidis pathogenesis was also a goal of the described work. Some experimental approaches were developed or optimized in order to assess initial adhesion, biofilm formation and PNAG production with accurate and expedite methods. According to the results, initial adhesion and biofilm maturation are two distinct phenomena, and may influence virulence differently. Initial adhesion was found to be dependent on the surface composition, being hydrophobic surfaces more prone to bacterial adhesion. Biofilm formation was not so strongly affected by the substratum surface properties. It was also demonstrated that sub-inhibitory concentrations of antibiotics differently influence initial adhesion and biofilm formation abilities. Additionally, biofilms formed in the presence of sub-inhibitory concentrations of antibiotics exhibit alterations in their structures and matrix compositions and the biofilm cells acquire enhanced resistance to antibiotics. The results also revealed that S. epidermidis biofilm cells are more resistant to antibiotics that target cell wall synthesis but fairly susceptible to antibiotics that target RNA and protein synthesis, when compared to their equivalent planktonic populations. Biofilm cells proved to be more resistant to the lytic action of phage K than their exponentially grown planktonic counterparts, possibly due to the lower growth rate of biofilm bacteria. Furthermore, it was also demonstrated that biofilm cells are more resistant to phagocytosis (evaluated in vitro and in vivo), probably due to the high levels of PNAG expression, since PNAG is a known inhibitor of phagocytosis. The role of PNAG on Staphylococci virulence was also established by the direct relation between biofilm formation ability and level of PNAG expression. The molecular studies of PNAG production demonstrated that the icaB gene, present on the intercellular adhesion locus (ica), plays an important role in the virulence of Staphylococcus spp, mediating PNAG anchorage to the cell surface or release into the extracellular media, acting as a possible decoy to the immune system. This newly described mechanism highlighted the role of PNAG in biofilm resistance to the immune system. Finally, and focusing on the role of PNAG as a target to vaccine development, several pathogenic genera were screened for PNAG production. The fact that an immunological similar polysaccharide to the Staphylococcal PNAG was detected on the cell surface of several strains of E. coli, Yersinia spp. and Bordatela spp, opens the possibility for the development of a broad vaccine against some of the major human pathogens.

A espécie Estafilococos epidermidis assim como outras espécies de Estafilococos é actualmente reconhecida com uma importante espécie nosocomial patogénica associada a um grande número de infecções relacionadas com a utilização de implantes médicos invasivos. A capacidade que esta espécie apresenta para aderir a superfícies e para formar biofilmes é considerada um dos factores de virulência preponderantes. Os biofilmes são estruturas complexas que conferem às células bacterianas resistência aos antibióticos e às defesas naturais do organismo. O trabalho descrito nesta dissertação teve como objectivo principal o estudo da capacidade de adesão e formação de biofilmes de várias estirpes clínicas de Estafilococos bem como a determinação das alterações fisiológicas induzidas pelo fenótipo de biofilme e a importância da segregação do polissacárido poli-N-acetilglucosamina (PNAG), um constituinte importante do biofilme. Os estudos conduzidos e aqui descritos pretendem explicar as implicações das características fenótipicas dos biofilmes de Estafilococos na virulência desta espécie. Foi necessário desenvolver um conjunto de metodologias que permitem de forma expedita e fidedigna estudar a capacidade de adesão, de formação de biofilme, bem como de quantificação de PNAG. Os resultados obtidos permitiram concluir que a capacidade de adesão é dissociada da capacidade de formação de biofilme pelo que adesão e formação de biofilme devem se considerados dois fenómenos distintos. Consequentemente demonstrou-se que a composição da superfície de adesão implica o fenómeno de adesão, sendo ele mais favorável a superfícies hidrofóbicas, afectando de forma não linear a formação de biofilme. Do mesmo modo demonstrou-se que concentrações sub-inibitórias de antibióticos afectam de forma diferente a adesão a superfícies e a formação de biofilme, e verificou-se também que os biofilmes formados na presença de concentrações sub-inibitórias de antibióticos apresentam alterações na composição e estrutura da matriz e aumento de resistência a certos antibióticos. Os estudos realizados permitiram ainda concluir que os biofilmes de Estafilococos são mais resistentes à acção de antibióticos do que as células suspensas, especialmente os que actuam ao nível da síntese da parede, tendo no entanto sido susceptíveis a antibióticos que afectam a replicação de RNA e a produção de proteínas. Os biofilmes de Estafilococos mostraram-se também mais resistentes à acção lítica do bacteriófago K, possivelmente devido à baixa taxa de crescimento das células no biofilme. Também se verificou que populações de bactérias crescidas em biofilmes apresentavam maior resistência à fagocitose (avaliada in vitro e in vivo), possivelmente devido à elevada quantidade de PNAG detectada na sua superfície celular e na matriz do biofilme, visto que PNAG é um conhecido inibidor da fagocitose. Esta molécula parece ser determinante na formação dos biofilmes uma vez que biofilmes mais espessos apresentam maior quantidade de PNAG. Os estudos moleculares realizados permitiram concluir que o gene icaB, presente no operão ica, desempenha um papel crucial na virulência de Estafilococos, mediando a fixação da PNAG na superfície celular ou a libertação para o meio externo, funcionado então como uma possível defesa contra o sistema imune do hospedeiro, sendo este um novo mecanismo descrito elucidando melhor a capacidade de resistência dos biofilmes de Estafilococos ao sistema imune. A PNAG parece ser ubíqua em espécies de importância clínica, uma vez que se detectou a presença de uma molécula imunologicamente semelhante à PNAG em estirpes clínicas de Escherichia coli, Yersinia spp. e Bordatela spp. Esta descoberta poderá abrir novas perspectivas no desenvolvimento de vacinas capazes de combater diferentes agentes patogénicos.