Combination of cellular therapy with peptide-modified gellan gum hydrogels for spinal cord injury repair

Abstract

Spinal Cord Injury (SCI) is a highly debilitating condition, with devastating consequences for the patients and their families. Partial or complete loss of motor and sensorial functions below the level of injury are the main visible outcomes. However, cardiac and respiratory compromise, together with bladder and bowel dysfunctions, among others, are frequently observed, impairing significantly the quality of life. Currently there are no treatments for SCI, with most approaches being used in order to minimize injury progression. The lack of treatments can be attributed to the aggressive pathophysiology of SCI. The initial impact immediately leads to massive tissue damage and neuronal death, with edema formation and hemorrhages. For the next minutes up to several weeks, a cascade of cellular and molecular secondary alterations is triggered, leading to further neuronal damage. Finally, in the chronic phase, a glial scar and a cystic cavity are formed, creating a physical and chemical barrier to regeneration. Considering the injury complexity and the multitude of secondary alterations that can be targeted, it is more likely that a combinatorial therapeutic approach will have more impact than single-based therapies. Among the different approaches, tissue engineering (TE) and regenerative medicine concepts could be of extreme relevance for SCI. Cellular transplantation, one of the cornerstones of TE, has been applied in SCI research for decades. Nonetheless, and despite the numerous studies in the field, most of them fail when translated into the clinics. Combining biomaterial-based strategies with cell therapies could solve some of the associated problems, such as the low cell survival after transplants. In this way, the work developed during this thesis aimed to develop a combinatorial approach, conjugating the transplantation of two different cellular populations with a functional hydrogel, serving both as a physical matrix for neuronal regrowth and as a vehicle for cell transplantation. Thus, gellan gum hydrogel, previously modified with fibronectin-derived peptides (GGGRGDS), was combined with adipose tissue-derived stem/stromal cells (ASCs) and olfactory ensheathing cells (OECs). Both cell types have been associated with promising protective and regenerative effects, in different models of SCI. In this work, we firstly showed that ASCs and OECs could grow in vitro, in direct coculture systems, without affecting their morphology, growth and viability. In addition, their combination was beneficial in vitro, resulting in increased axonal growth using a model of axonal regeneration (Dorsal Root Ganglia – DRG – explants). Then, ASCs/OECs were applied as a single transplantation into a rat thoracic hemisection model of injury (T10 level). The treatment led to significant recovery of hindlimb function, which was associated with reduced levels of inflammation at the lesion site. Later, cells were encapsulated within GG-GRGDS hydrogels and demonstrated a normal morphology and growth in vitro. Moreover, their combined application into a lumbar hemisection model, led to a significant recovery of locomotor function. The histological analysis showed reduction in inflammation, astrogliosis and an increased number of neurofilament positive staining, possible indicative of axonal regeneration or neuronal protection. Finally, the same strategy was implemented in a cervical model of injury, which induces respiratory deficits, affecting diaphragmatic function. Following a C2 hemisection, hydrogel and cells were transplanted at the injury site, immediately after lesion. The combinatorial treatment induced the most significant recovery of diaphragmatic function, as assessed by electromyogram activity of the ipsilateral hemi-diaphragm. Both ventral and medial portions of the diaphragm were partially recovered. Moreover, and despite no differences were seen in forelimb motor function, GG-GRGDS and ASCs/OECs induced a significant recovery of sensorial perception, in the contralateral forelimb, as measured by the Von Frey test. All together, these results disclose a great therapeutic potential for the application of GGGRGDS hydrogels with ASCs and OECs, since its application to different models of injury resulted in significant and relevant improvements of function. Not only motor behaviors associated with locomotion were recovered, but also motor control of the diaphragm, essential for respiration, and also sensorial perception recovery. In addition, all components of this approach could be translated to the clinics, as ASCs and OECs can be obtained from autologous sources and gellan gum proved to be biocompatible, with low immunogenic potential. This work presents an important strategy for SCI repair, that with further pre-clinical testing in larger animal models, could be one day applied to the clinics.

As lesões vertebro-medulares (LVM) são uma condição debilitante, com consequências devastadoras quer para pacientes como para as suas famílias. A perda parcial ou total das capacidades motoras e sensoriais abaixo do local da lesão é a consequência mais notória. Contudo, problemas cardíacos e respiratórios, assim como disfunção dos sistemas urinário e gastrointestinal, entre outros, acontecem frequentemente, reduzindo significativamente a qualidade de vida. Atualmente não existem tratamentos para as LVM, com a maioria das abordagens a ser utilizada apenas de modo a minimizar a progressão da lesão. A falta de tratamentos pode ser atribuída à agressiva fisiopatologia da doença. O impacto inicial leva a um dano tecidular e morte neuronal imediatas, com formação de edema e hemorragia. Durante os minutos seguintes, até várias semanas, uma série de alterações celulares e moleculares é ativada, conduzindo a um aumento do dano neuronal. Por fim, na fase crónica, são formadas a cicatriz glial e a cavidade cística, criando uma barreira física e química à regeneração. Tendo em conta a complexidade e a panóplia de alterações secundárias que podem ser usadas como alvo terapêutico, é provável que tratamentos baseados em abordagens combinatórias terão um maior impacto do que estratégias singulares. Dentro das várias possibilidades, os conceitos usados em engenharia de tecidos e medicina regenerativa poderão ser de uma grande relevância para as LVM. O transplante celular é um dos pilares da engenharia de tecidos e tem vindo a ser aplicado na investigação em LVM desde há décadas. Não obstante, e apesar do elevado número de trabalhos neste campo, a grande maioria falha quando tenta ser aplicado na clínica. Combinar estratégias baseadas em biomateriais com terapias celulares poderá resolver alguns dos problemas associados a esta abordagem, nomeadamente a baixa sobrevivência das células após transplante. Deste modo, o trabalho desenvolvido durante esta tese teve como objetivo desenhar uma abordagem combinatória, conjugando o transplante de duas populações celulares distintas com um hidrogel modificado, que serve tanto como uma matriz física para o crescimento neuronal, assim como um veículo para o transplante celular. Neste sentido, o hidrogel goma gelana, previamente modificado com péptidos derivados de fibronectina (GG-GRGDS), foi combinado com células estaminais do tecido adiposo (ASCs) e células envolventes do bolbo olfativo (OECs). Ambos os tipos celulares têm sido associados a efeitos neuro-protetores e neuro-regenerativos, em diferentes modelos de LVM. Neste trabalho, primeiramente demonstramos que ASCs e OECs crescem in vitro, em sistemas de co-cultura direta, sem que sejam afetadas as suas morfologias, proliferação e viabilidade. Para além disso, a sua combinação foi benéfica, levando a um crescimento de neurites, num modelo in vitro de regeneração axonal. De seguida, ASCs/OECs foram transplantadas para um modelo de rato de hemisecção torácica (nível T10). O tratamento induziu uma recuperação significativa da função das patas traseiras, o que esteve associado a níveis reduzidos de inflamação no local da lesão. Mais tarde, as células foram também encapsuladas em hidrogéis de GG-GRGDS e apresentaram uma morfologia e crescimento normais in vitro. Adicionalmente, a sua aplicação conjunta num modelo de hemisecção lombar (mais agressivo) levou a uma melhoria significativa da locomoção. A análise histológica permitiu perceber uma redução da inflamação, da astrogliose e aumento da marcação para neurofilamento, possível indicador de regeneração axonal ou de maior proteção neuronal. Por fim, a mesma estratégia foi implementada num modelo de lesão cervical, que induz défices respiratórios, afetando a função do diafragma. Após hemisecção em C2, hidrogel e células foram imediatamente transplantados, no local de lesão. O tratamento combinado levou a uma maior recuperação da função do diafragma, avaliada por eletromiograma do músculo ipsilateral do diafragma. As regiões mais dorsal e medial do diafragma demonstraram uma recuperação parcial da função. Apesar de não terem sido observadas diferenças na função motora das patas dianteiras, a terapia combinatória ajudou a recuperar a função sensorial, da pata dianteira contralateral, após avaliação com filamentos de Von Frey. Resumindo, estes resultados revelam um grande potencial terapêutico para o uso de hidrogéis de GG-GRGDS com ASCs e OECs, dada a sua aplicação com sucesso a diferentes modelos de lesão, com melhorias de função significativas. Não só comportamentos como a locomoção foram melhorados, mas também o controlo do diafragma foi recuperado parcialmente, o que é essencial para a função respiratória, e ainda a perceção sensorial. Mais ainda, todas as componentes desta abordagem podem ser facilmente aplicadas na clínica, visto ser possível obter ASCs e OECs de uma maneira autóloga (do próprio paciente) e ao facto da goma gelana ser biocompatível, com baixa probabilidade de provocar uma reação imune. Este trabalho apresenta uma abordagem relevante para as LVM, que após mais estudos pré-clínicos em animais de maior porte, poderá um dia vir a ser aplicado em pacientes.