Extração e purificação de ADN de amostras vegetais de videira combinando microextração por fase sólida (μSPE) e microfluídica

Abstract

A qualidade do vinho depende de fatores como o processo de vinificação, solo, condições climáticas e casta. Na sua produção podem ser usadas uma grande variedade de castas de Vitis vinífera, contudo apenas um pequeno número destas possuem importância comercial. O desenvolvimento de métodos confiáveis para rastrear videiras e vinhos têm-se tornado um forte objetivo devido à crescente procura pela proteção de origem de produtos. Os métodos baseados em ADN têm-se demonstrado objetivos na diferenciação de castas. A extração e purificação eficaz de ADN é condição essencial para que estes métodos possam ser aplicados, sendo necessário obter ADN em quantidade suficiente e puro. Este estudo teve o intuito de desenvolver um protocolo eficiente de extração e purificação de ADN de amostras vegetais de videira num novo protótipo de dispositivo microfluídico, comparando-o ao kit comercial DNeasy® PowerSoil® Pro Kit (Qiagen). A performance fluídica e de diversos protocolos foram avaliados no protótipo para o otimizar. A extração e purificação de ADN foi realizada para 10 castas da região do Douro e 3 do Minho, seguindo o procedimento do kit selecionado e no dispositivo desenvolvido com o protocolo selecionado na otimização. O protótipo de 15 mm usa menos volumes de soluções e é mais rápido relativamente ao de 21 mm. Ambos os protocolos 2.1 e 3 apresentam rendimentos aproximados de 50 %, contudo o protocolo P2.1 é preferível a este por possibilitar a integração e possuir menor variabilidade de resultados. Assim, o protótipo de 15 mm e o protocolo P2.1 foram usados no seguimento do estudo. O dispositivo miniaturizado demonstrou extração de ADN eficiente em folhas de videira e uvas em comparação ao kit comercial DNeasy® PowerSoil® Pro Kit (Qiagen). Futuramente, são necessários estudos com matrizes mais complexas e melhorar a pureza das amostras obtidas, avaliar a amplificação do ADN extraído pelo sistema e, por fim, a sua integração com os módulos de amplificação e deteção para um sistema completo de análise de ADN (μTAS).

Wine quality depends on several factors such as grape variety, the winemaking process, soil, and climatic conditions. Despite the wide range of Vitis vinífera varieties used in winemaking, only a small number of these have commercial importance. The demands of protection to the product provenience lead to the development of reliable methods to track grapevines and wines becoming a growing objective. DNA-based methods are objective in differentiating grapevine varieties. Effective DNA extraction and purification is an essential condition for these methods to be applied. It is needed to obtain enough and pure DNA. This study aimed to develop an efficient DNA extraction and purification protocol from vegetable grapevine samples in a new microfluidic device prototype, comparing it to the commercial kit DNeasy® PowerSoil® Pro-Kit (Qiagen). Fluidics performance was evaluated in the prototype, as well, four protocols to optimize the extraction. DNA extraction and purification were performed in ten varieties from Douro region, and three from Minho. DNA extraction and purification were carried by the protocol from the kit selected and to the device developed. The 15 mm prototype uses fewer volumes of solutions and it is faster than the 21 mm. Both protocols 2.1 and 3 show approximate yields of 50 %. However, the P2.1 protocol is preferable since it allows integration and has less variability in results. Thus, the 15 mm prototype and the P2.1 protocol were selected to carry on the study. The miniaturized device demonstrated efficient DNA extraction from grape leaves and grapes compared to the commercial kit DNeasy® PowerSoil® Pro-Kit (Qiagen). In the future, it is needed studies with more complex matrices, to improve the purity of the samples obtained; evaluate the amplification of the DNA extracted by the system, and finally, its integration with the amplification and detection modules for a complete DNA analysis system (μTAS).