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TítuloSugar transport in vitis vinifera and olea europaea
Outro(s) título(s)Transporte de açúcares em vitis vinifera e olea europaea
Autor(es)Conde, Carlos Alberto da Silva
Orientador(es)Gerós, H.
Tavares, R. M.
Data26-Nov-2007
Resumo(s)Plants are essential for energy input into the living world. As photoautotrophic multicellular organisms, higher plants represent complex mosaics of highly differentiated tissues that fulfil specific functions. These specializations are accompanied by a loss of tissue autonomy making it indispensable for different cell types to collaborate even over long distances. Plants produce carbohydrates by the fixation of carbon dioxide during photosynthesis that takes place in the chloroplasts of mesophyll cells of mature leaves. Heterotrophic cells in the roots, reproductive structures, storage and developing organs rely on the supply of this assimilated carbon for their growth and development. Plant sugar transporters play a crucial role in assimilate partitioning, ensuring efficient phloem loading at source tissues and the adequate supply of carbohydrates to sink tissues. Morphogenesis, development, and ultimately plant productivity depend on a constant and fine regulation of plant sugar transporters expression and activity, which allows coordinate exchanges between the different cells, tissues and organs. The studies presented in this work, aim for a better understanding of the biochemical and molecular mechanisms involved in the transmembrane transport of photoassimilates in higher plants, how this critical cellular process is regulated and how it may help plants to cope with harsh physiological conditions such as limited sugar availability and increased salinity. Special attention was devoted to the study of photoassimilate transport in Olea europaea and Vitis vinifera. These plant species represent two of the most important agricultural and economical crops in the World. Chapter 1 presents a General Introduction regarding transport of photoassimilates and its regulation in higher plants. In Chapter 2 the biochemical and molecular events occurring during olive fruit development and maturation, in particular fatty acid and triacylglycerol synthesis are revised, as well as the key role of mannitol and monosaccharide transporters in providing carbon skeletons for the corresponding biosynthetic pathways and energy for cellular metabolism in general. This leads the way to Chapter 3, in which the identification and characterization of a H+-dependent mannitol transport system in cultured cells of O. europaea is presented. In the scope of this work, a partial cDNA sequence of the corresponding gene was cloned and named OeMaT1 (O. europaea mannitol transporter 1). Results show that mannitol/H+ symport activity in cultured cells is well correlated with OeMaT1 transcription that is strongly induced by high concentrations of NaCl in the culture medium resulting in a dramatic increase of mannitol transport activity. Together with the down-regulation of mannitol dehydrogenase activity, this results in the increase of intracellular mannitol accumulation in order to compensate the decrease of external water activity, thus providing a tolerance mechanism to salinity in O. europaea. O. europaea, as a stachyose and raffinose producing plant, translocates these oligosaccharides throughout the phloem. At sink tissues, in particular olive fruits, stachyose and raffinose are converted into the constituent monosaccharides by the combined action of extracellular α-galactosidase and invertase activities. The uptake of the resulting glucose, fructose and galactose into olive fruit cells is mediated by the monosaccharide/H+ symporter, OeMST2. Expression of OeMST2 cDNA in an hxt-null Saccharomyces cerevisiae strain restored its capacity to grow on and transport with high affinity glucose. Kinetic and energetic studies performed in the transformed yeast confirmed the role of OeMST2 as a monosaccharide/H+ symporter. OeMST2 was shown to be strongly expressed throughout fruit maturation, where it is believed to play a crucial role in the massive accumulation of monosaccharides into olive fruits. These results are presented and discussed in Chapter 4. In O. europaea cultured-cells, besides H+-dependent transport (saturable), at least partly mediated by OeMST2, a superimposed diffusional transport (linear) component represents the major mode of uptake at high external glucose concentrations. In Chapter 5, the nature of this low-affinity, high-capacity, diffusional component is studied providing the bases to understand its physiological significance for the plant. The involvement of a facilitated diffusion through a mercury-sensitive hydrophilic channel whose transport capacity may be regulated by intracellular protonation and phosphorylation/dephosphorylation is postulated. In addition to their function as metabolic resources, sugars are also important regulators of many processes associated with plant growth, maturation, senescence, stress responses, and in the integration of environmental inputs. Their regulatory activities include both the repression and induction of many genes involved in essential metabolic processes. The ability to sense alteration of sugar concentrations is important in the context of resource allocation allowing the plant to tailor its metabolism to face wildly fluctuating sugar levels. Results presented in Chapter 6 show that sugar transport in cultured-cells of V. vinifera is tightly regulated by sugar levels in the medium. The data indicate that VvHT1 (V. vinifera hexose transporter1), a high-affinity monosaccharide/H+ symporter previously identified in grape berry during maturation, mediates most of glucose transport activity in grape cultured-cells. High glucose levels repress VvHT1 expression involving both a hexokinase-dependent decrease of VvHT1 transcription and a hexokinase-independent post-transcriptional regulation. The same pattern of regulation was observed for OeMST2 expression (chapter 4), supporting the role of hexokinase as a sugar sensor mediating a glucose repression pathway of monosaccharide transporters expression at least in some plant species. V. vinifera is a particularly attractive and convenient working model to study the regulation of monosaccharide transporters expression and activity by sugars. The presence of both positive (inducing) and negative (repressing) sugar response cis elements in the VvHT1 promoter region suggests that this transporter is under complex control by sugars. Moreover, grape berry development and ripening is characterized by massive sugar import into the berries. In Chapter 7, a general overview of the biochemical events that occur throughout berry development and ripening is presented. Although sugars are either partially or completely transformed during wine production, sugar import and accumulation into the ripening berry is a major parameter determining wine quality. Sugar status is directly related to the final alcoholic content of wine, and regulates several genes responsible for the development of its aromatic and organoleptic properties. In conclusion, the mechanisms of sugar transport into sink cells of two important plant species were studied in detail at a biochemical and molecular level. Mannitol uptake revealed to be a critical response process to high salinity in O. europaea as well in providing mannitol as an efficient carbon and energy source for cellular growth and development. Monosaccharide transport was shown to be highly regulated by sugar levels both at the transcriptional and post-transcriptional level. A solid set of results support the role of hexokinase as a sugar sensor responsible for the activation of the pathway leading to the transcriptional repression of some monosaccharide carriers. In heterotrophic cell cultures, glucose uptake revealed to be mediated by the operation of a saturating high-affinity H+-dependent transport system superimposed to a low-affinity/high capacity diffusion-like transport. While the former is the result of the fairly known plant monosaccharide carriers’ activity, the latter transport mode for sugars may represent a new and exciting research area in plant biology as it seems to involve the activity of a channel-like protein structure yet to be identified at the molecular level. The careful characterization of the membrane transport processes (and how they are regulated) underlying resource allocation is crucial to fully understand source - sink regulation and to be in a position to manipulate the complex interactions for agricultural benefit.
As plantas são essenciais para a introdução de energia e de componentes estruturais nos sistemas vivos. Como organismos multicelulares e fotoautotróficos, as plantas superiores representam complexos mosaicos de tecidos altamente diferenciados que desempenham funções específicas. Esta especialização é acompanhada por uma perda de autonomia dos tecidos tornando indispensável a interacção das células, ainda que separadas espacialmente. As plantas produzem hidratos de carbono por intermédio da fixação de CO2 nos cloroplastos das células do mesófilo das folhas maduras. As células heterotróficas das raízes, das estruturas reprodutivas e dos órgãos de armazenamento ou em desenvolvimento, como as folhas jovens, dependem do fornecimento deste carbono assimilado. Os transportadores de açúcar desempenham um papel crucial na distribuição dos fotoassimilados, garantindo a sua incorporação eficiente nos vasos condutores (floema) ao nível dos tecidos produtores, bem como o fornecimento adequado ao nível dos tecidos heterotróficos (descarregamento do floema). A morfogénese, o desenvolvimento e, consequentemente, a produtividade vegetal, dependem de mecanismos de regulação sensíveis da expressão e actividade dos transportadores de açúcar, permitindo assim trocas organizadas entre os tecidos autotróficos e os tecidos heterotróficos. Os estudos apresentados no presente trabalho de tese, pretendem contribuir para a compreensão dos mecanismos bioquímicos e moleculares envolvidos no transporte transmembranar de fotoassimilados nas plantas superiores e de como este processo celular é regulado, permitindo à planta responder a condições fisiológicas adversas, tais como disponibilidade limitada de açúcares ou salinidade elevada. É dedicada atenção especial ao estudo do transporte de fotoassimilados em Olea europaea (oliveira) e Vitis vinífera (videira), duas espécies vegetais de grande importância económica e agrícola. Após uma Introdução Geral sobre o transporte de açúcares e a sua regulação em plantas (Capítulo 1), no Capítulo 2 é apresentada uma revisão sobre os eventos bioquímicos e moleculares que ocorrem ao longo do desenvolvimento e amadurecimento da azeitona. Atenção especial é dada à síntese de ácidos gordos e triglicerídeos, bem como ao papel chave dos transportadores de manitol e de monossacarídeos na disponibilização de esqueletos de C para as respectivas vias biossintéticas e de energia para o metabolismo celular. No Capítulo 3 são apresentados e discutidos resultados sobre a identificação e caracterização de um sistema de transporte de polióis dependente de H+ em células em suspensão de O. europaea. No âmbito deste trabalho, foi clonada uma sequência parcial de cDNA denominada OeMaT1 (O. europaea mannitol transporter 1). A actividade do simportador manitol/H+ demonstrou estar correlacionada com a transcrição do gene OeMaT1 que é fortemente induzida por elevadas concentrações de NaCl presentes meio de cultura, resultando num incremento significativo da actividade de transporte do manitol. Em paralelo, elevadas concentrações de NaCl, provocam a diminuição da actividade da enzima manitol desidrogenase, responsável pelo primeiro passo de conversão intracelular do manitol, resultando na acumulação intracelular deste composto de modo a compensar a diminuição de actividade da água no espaço extracelular. Foi então demonstrado que o manitol, para além do seu papel em O. europaea como importante fonte de carbono e energia, actua como soluto compatível uma vez que a sua acumulação intracelular constitui um mecanismo de tolerância à salinidade. O. europaea produz estaquiose e rafinose ao nível dos tecidos fotossintéticos e transporta estes oligossacarídeos ao longo do floema. Ao nível dos tecidos heterotróficos, em particular nos tecidos do fruto, a estaquiose e a rafinose são convertidas nos monossacarídeos constituintes por intermédio da actividade de α-galactosidases e invertases extracelulares. A incorporação da glucose, frutose e galactose nas células da azeitona é mediada, pelo menos em parte, pelo transportador OeMST2, que medeia o co-transporte de monossacarídeos com H+. A expressão do cDNA OeMST2 numa estirpe mutante de Saccharomyces cerevisiae deficiente no transporte da glucose (“hxt-null”) restaurou a capacidade da levedura crescer em meio com glucose e de transportar o açúcar com elevada afinidade. Estudos cinéticos e energéticos conduzidos na levedura transformada confirmaram o papel da proteína OeMST2 como simportador de monossacarídeos com H+. O respectivo gene, OeMST2, revelou ser fortemente expresso ao longo do amadurecimento da azeitona, onde deve desempenhar um papel crucial na acumulação de monossacarídeos. Estes resultados são apresentados e discutidos no Capítulo 4. Em células em suspensão de O. europaea, para além do sistema de transporte activo do tipo monossacarídeo/H+ (saturável), mediado, pelo menos em parte, pelo transportador OeMST2, uma componente difusional (linear) representa o único modo de transporte na presença de elevadas concentrações de glucose extracelular. No Capítulo 5 pretende-se clarificar a natureza desta componente de transporte difusional, de baixa afinidade e de elevada capacidade, bem como contribuir para a compreensão da relevância fisiológica deste mecanismo para a planta. É postulado o envolvimento de transporte do tipo difusão facilitada mediado um canal hidrofílico sensível ao mercúrio, regulado por protonação intracelular e fosforilação/desfosforilação, estrutura proteica ainda por identificar ao nível molecular. A possibilidade dos monossacarídeos poderem ser transportados por canais semelhantes a aquaporinas pode representar uma mudança significativa do paradigma do transporte transmembranar de açúcares nos seres vivos. Para além de actuarem como precursores metabólicos, os açúcares constituem importantes moléculas reguladoras de inúmeros processos associados com o crescimento, a maturação, a senescência, e a resposta ao stresse, bem como com a integração de vários sinais ambientais. Algumas das actividades reguladoras dos açúcares incluem a repressão e indução de vários genes envolvidos em processos metabólicos essenciais. A capacidade de percepção do açúcar permite à planta adaptar o metabolismo de acordo com a sua disponibilidade no meio extracelular, mecanismo importante no contexto da distribuição de fotoassimilados. No Capítulo 6 são apresentados resultados que mostram que o transporte de açúcares em células em suspensão de V. vinifera é rigorosamente regulado pelos níveis de açúcar do meio de cultura. Neste modelo celular o transporte da glucose é mediado por um simportador do tipo monossacarídeo/H+ de elevada afinidade, VvHT1 (V. vinifera hexose transporter1), previamente identificado na uva durante o processo de amadurecimento. A transcrição do gene VvHT1 é fortemente reprimida por elevadas concentrações de glucose ou de 2-desoxiglucose, mas não pelo análogo não fosforilável 3-O-metil-D-glucose ou por glucose na presença de manoheptulose, sugerindo o envolvimento de um mecanismo de repressão dependente da hexocinase. A 3-O-metil-D-glucose ou a glucose na presença de manoheptulose induzem a diminuição da actividade transportadora pela redução da quantidade de VvHT1 na membrana plasmática, sem afectar os níveis de transcritos do respectivo gene, sugerindo o envolvimento de um mecanismo de regulação pós-transcricional independente da hexocinase. Pela primeira vez em plantas foi mostrado que os transportadores de açúcares podem ser regulados pelo próprio substrato ao nível transcricional e pós-transcricional. Um padrão de regulação semelhante foi observado para a expressão do gene OeMST2 (Capítulo 4), suportando o papel da hexocinase como sensor de glucose responsável pela activação da via de repressão da expressão de transportadores de monossacarídeos pela glucose, pelo menos em algumas espécies vegetais. V. vinifera é um modelo vegetal particularmente atractivo para o estudo da regulação da expressão de transportadores de monossacarídeos pelos níveis de açúcar. A presença de vários elementos cis de resposta a açúcares no promotor do gene VvHT1 sugere que a sua expressão está sujeita a uma complexa regulação pelos níveis de açúcar. O processo de desenvolvimento e amadurecimento da uva é caracterizado pela acumulação de elevadas concentrações de açúcares no vacúolo das células do mesocarpo. No Capítulo 7 é apresentada uma revisão sobre os eventos bioquímicos e moleculares que ocorrem durante este processo. O transporte e acumulação de açúcares nas uvas constituem dois dos principais parâmetros que determinam a qualidade do vinho, embora presentes em quantidades residuais no produto final. Com efeito, os níveis de açúcar das uvas estão directamente relacionados com o teor alcoólico final do vinho e regulam a expressão de inúmeros genes responsáveis pelo desenvolvimento das propriedades aromáticas e organolépticas do fruto e, consequentemente, do vinho. No seu conjunto, os resultados obtidos no presente trabalho de tese permitiram contribuir para a elucidação dos mecanismos envolvidos no transporte de açúcares em duas espécies vegetais de elevada importância económica, a videira e a oliveira. A caracterização detalhada dos processos de transporte transmembranar de açúcares, e da sua regulação, é crucial para uma melhor compreensão dos mecanismos de interacção entre os tecidos produtores e consumidores das plantas, podendo a sua manipulação contribuir no futuro para o aumento da produtividade das espécies vegetais.
TipoTese de doutoramento
DescriçãoTese de Doutoramento em Ciências
URIhttps://hdl.handle.net/1822/7331
AcessoAcesso restrito UMinho
Aparece nas coleções:BUM - Teses de Doutoramento
CBFP - Teses de Doutoramento
DBio - Teses de Doutoramento/Phd Theses

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