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https://hdl.handle.net/1822/73682
Título: | Development of a new Colon-Host simulator: optimization of the cell-based module |
Outro(s) título(s): | Desenvolvimento de um novo simulador Colon-Hospedeiro: otimização do módulo celular |
Autor(es): | Parente, Inês Araújo |
Orientador(es): | Gonçalves, Clarisse Salomé Nobre Botelho, C. M. Gonçalves, Catarina |
Palavras-chave: | Caco-2/HT29-MTX co-culture Colon-host interactions Gut microbiota Intestinal in vitro models Caco-2/HT29-MTX co-cultura Interações colon-hospedeiro Microbiota intestinal Modelos intestinais in vitro |
Data: | 2021 |
Resumo(s): | The dynamic nature and the unique composition of the gut is difficult to simulate leading to a limited
understanding of the microbiota-host interactions. Several in vitro gastrointestinal models have been
developed over the years however, aspects need to be improved such as the stability of the ecosystem of
microbial and host cells. The ColOsH model is being developed to solve the limitations of the existing
models. The ColOsH contains a specific module for the culture of intestinal cells – the Colon-Host, in
which the interaction between the gut microbiota and intestinal cells will be studied.
The present work aims to optimize the cell-based module so that in the future, the methodologies
established here can be transposed to the Colon-Host. The Caco-2/HT29-MTX cell culture model was
used and the response of the intestinal in vitro epithelium to products of the prebiotic fermentation by the
human microbiota was studied. With the goal to study their prebiotic effect, fructo-oligosaccharides (FOS)
and raftilose were used as carbon sources for the growth of the microbiota present in human faeces.
The effect of the fermentation products was studied on the cell viability, production of reactive oxygen
species, intestinal permeability, transepithelial electrical resistance and expression of tight-junction
specific proteins (imaged by laser scanning confocal microscopy) of the Caco-2/HT29-MTX co-culture.
The inflammatory response was investigated by the quantification of the secretion of the IL-8 chemokine
by ELISA and the expression of inflammatory response mediators’ genes (IL1B, IL6, CXCL8, TNF and
PTGS2) by qRT-PCR.
First results shown that the effect of fermentation products on the metabolic activity of Caco-2 cells was
dependent on both concentration and incubation time. The optimization of these parameters ensured the
viability of Caco-2 cells and Caco-2/HT29-MTX cells grown in co-culture, setting the standard conditions
for the following experiments. Samples did not compromise the integrity of the intestinal barrier of the
Caco-2/HT29-MTX co-culture and samples fermented with FOS-enriched media revealed a significant
antioxidant effect. At last, the fermentation products tested did not promote a significant inflammatory
response.
This work provided the optimization of several protocols and parameters allowing future tests to be
performed in the Colon-Host simulator with a better representation of the intestinal epithelium. A natureza dinâmica e composição única do intestino são difíceis de simular levando a um conhecimento limitado sobre as interações microbiota-hospedeiro. Vários modelos gastrointestinais in vitro têm vindo a ser desenvolvidos, contudo aspetos como a estabilidade do ecossistema microbiano ou das células do hospedeiro necessitam ser melhorados. O modelo ColOsH está a ser desenvolvido para solucionar as limitações dos modelos existentes. O ColOsH contém um módulo específico para a cultura de células intestinais - o Colon-Host, no qual será estudada a interação entre a microbiota e as células intestinais. O presente trabalho visa otimizar o módulo celular para que, no futuro, as metodologias aqui estabelecidas possam ser transpostas para o Colon-Host. O modelo de cultura celular Caco-2/HT29-MTX foi usado e a resposta do epitélio intestinal aos produtos da fermentação de prebióticos pela microbiota humana foi estudada. Com a finalidade de estudar o seu efeito prebiótico, frutoligossacarídeos (FOS) e raftilose, foram usados como fontes de carbono para o crescimento da microbiota de fezes humanas. O efeito dos produtos obtidos durante a fermentação foi estudado na viabilidade celular, produção de espécies reativas de oxigênio, permeabilidade intestinal, resistência elétrica transepitelial e expressão de proteínas específicas das tight junctions (microscopia confocal de varrimento a laser) da co-cultura Caco- 2/HT29-MTX. A resposta inflamatória foi investigada através da quantificação da secreção da citocina IL- 8 por ELISA e da expressão de genes pró-inflamatórios (IL1B, IL6, CXCL8, TNF e PTGS2) por qRT -PCR. Inicialmente, os resultados demonstraram que o efeito dos produtos da fermentação na atividade metabólica de células Caco-2 é dependente da concentração de metabolitos e do tempo de fermentação. A otimização destes parâmetros permitiu garantir a viabilidade das células Caco-2 e da co-cultura Caco- 2/HT29-MTX estabelecendo as condições padrão para os ensaios posteriores. Os produtos resultantes da fermentação demonstraram não comprometer a integridade da barreira da co-cultura Caco-2/HT29- MTX e as amostras das fermentações conduzidas em meio enriquecido com FOS revelaram ter um efeito antioxidante. Por fim, as amostras testadas não promoveram uma resposta inflamatória significativa. Este trabalho permitiu otimizar os parâmetros do módulo celular do simulador Colon-Host com uma melhor representação do epitélio intestinal. |
Tipo: | Dissertação de mestrado |
Descrição: | Dissertação de mestrado em Biotecnologia |
URI: | https://hdl.handle.net/1822/73682 |
Acesso: | Acesso aberto |
Aparece nas coleções: | BUM - Dissertações de Mestrado |
Ficheiros deste registo:
Ficheiro | Descrição | Tamanho | Formato | |
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