Desenvolvimento de genossensores eletroquímicos para a deteção de microalgas Alexandrium spp

Abstract

A aquacultura é uma atividade agropecuária em crescimento, cuja finalidade é aumentar a quantidade de alimentos, de origem aquática, disponíveis no mercado. Porém, como outras práticas agrícolas, a aquacultura também está sujeita a ameaças externas. Uma das possíveis ameaças para estes sistemas são as contaminações pelas florações nocivas de algas (HAB) – evento resultante do aparecimento em grande escala de microalgas e/ou cianobactérias potencialmente tóxicas. Em Portugal, os bivalves são dos organismos mais cultivados em aquacultura, pelo que apresentam um risco acrescido quando em contato com uma HAB, pois existem espécies, como a Alexandrium minutum, com a capacidade de produzir toxinas suficientes para representar uma ameaça para a saúde pública. Tendo em conta o aumento das HAB nas últimas décadas, surgiu a necessidade de desenvolver meios de deteção capazes de os antecipar, de maneira a prevenir ou, pelo menos, limitar a perda económica e biológica, incluindo a humana. Nesta dissertação foi desenvolvido e otimizado um genossensor eletroquímico para a deteção da A. minutum – microalga produtora de toxinas prejudiciais para a aquacultura portuguesa. Este dispositivo baseia-se na deteção eletroquímica da reação de hibridação de duas cadeias de ADN complementares. Analisando bases de dados públicas, selecionou-se e desenhou-se sequências de ADN especificas (70 pb) capazes de detetar inequivocamente o material genético proveniente da A. minutum. A construção do genossensor foi efetuada em várias etapas (i) Fase sensorial: criação de uma monocamada auto-organizada (SAM) mista constituída pelo ADN tiolado e o mercapto-hexanol (MCH) na superfície do elétrodo descartável de ouro (SPGE); (ii) Promoção da reação de hibridação do ADN em formato “sandwich” (para aumentar a seletividade) e; (iii) Deteção eletroquímica da reação de hibridação através da avaliação da reação de redução do substrato tetrametilbenzidina/peróxido (TMB/H2O2). Após a otimização de todos os parâmetros analíticos, fizeram-se curvas de calibração. Obteve-se uma correlação linear entre a corrente eletroquímica e a concentração de ADN alvo no intervalo de 0,12 e 1 nM. Os genossensores desenvolvidos apresentaram uma repetibilidade e reprodutibilidade de 5,4 % e 4,1 % respetivamente, e ainda um limite de deteção (LD) e um limite de quantificação (LQ) de 0,03 e 0,08 nM, respetivamente. ADN extraído e amplificado de amostras biológicas distintas (A. minutum, Lingulodinium polyedrum e células do epitélio oral) permitiram validar e confirmar a seletividade do genossensor. Este dispositivo também detetou o ADN complementar proveniente da A. minutum (a várias concentrações) e não registou nenhum sinal para as restantes amostras de ADN não complementares (L. polyedrum e as células do epitélio oral) às sondas de ADN usado na construção do sensor. Confirma-se assim que os genossensores são uma ferramenta analítica promissora e de baixo custo para monitorizar a presença de A. minutum em culturas puras, no mar e em tanques de aquacultura.

Aquaculture is a fast-growing activity of agricultural character; whose purpose is to increase the amount of aquatic food available on the market. Like other farming practices, aquaculture is also subject to external threats. One possible threat to these systems is the contamination by harmful algae blooms (HAB) – a large-scale event resulting from the appearance of potentially toxic microalgae and/or cyanobacteria. In Portugal, shellfish are the most cultivated organisms in aquaculture, thus representing an increased risk when in contact with a HAB because there are species, like Alexandrium minutum, with the ability to produce enough toxins to pose a threat to public health. In view of the increase phenomena of HAB, the need to develop means of detection capable of anticipating these threats, in order to prevent economic and human loss, has emerged. In this thesis, an electrochemical genosensor for the detection of Alexandrium minutum – a microalgae that produces harmful toxins for portuguese aquaculture – was developed and optimized. This device is based on the electrochemical detection of the hybridization reaction between two complementary DNA sequences. Analyzing public databases, a specific DNA probe (70 bp) capable of unequivocally detecting the genomic material of A. minutum was selected and designed. The construction of the genosensor was obtained in various steps (i) Sensorial phase: creation of the thiolated DNA and mercapto-hexanol mixed self-assembled monolayer (SAM) on the screen-printed gold electrode (SPGE) surface; (ii) Promotion of the DNA hybridization reaction in a sandwich format (to increase the selectivity) and; (iii) Electrochemical detection of the hybridization reaction by evaluating the reduction reaction of tetramethylbenzidine/peroxide (TMB/H2O2) substrate. After the optimization of all the analytical parameters, the calibration curve was determined. A linear correlation between the analytical signal (electrochemical current) and the DNA target concentration was obtained in the 0,12 and 1 nM range. The developed genosensor presents a repeatability and reproducibility of 5,4 % and 4,1 % respectively and a detection and quantification limit of 0,03 and 0,08, respectively. The extracted and amplified DNA from the different biological samples (A. minutum, Lingulodinium polyedrum and oral epithelium cells) validated and confirmed the selectivity of the genosensor. This device also detected the A. minutum complementary DNA (at various concentrations) and didn’t record any signal for the other non-complementary DNA samples (L. polyedrum and the oral epithelium cells) to the artificial probes used during the genosensors design. It is therefore confirmed that genosensors are a promising and low-cost analytical tool to monitor the presence of A. minutum in pure cultures, in the sea and in aquaculture tanks.