Enhancement of the biotechnological value of a commercial cold-adapted xylanase

Abstract

As xilanases são O-glicosídeo hidrolases que clivam as ligações internas β-1,4-D-xilosídicas do xilano, um dos principais polissacarídeos presente nas plantas. Elas são importantes biocatalizadores industriais com diversas aplicações. O presente projeto foi centrado numa xilanase adaptada ao frio e altamente ativa, com o principal objetivo de desenvolver a sua potencial exploração. Neste projeto consta tanto uma parte de investigação fundamental, como aplicada, o que permite o aumento do conhecimento e exploração desta xilanase e consequentemente a sua expansão em novos processos e produtos. Concretamente, desenvolvemos o uso desta xilanase na produção de produtos de valor acrescentado a partir de uma fonte marinha sustentável e caracterizámos os fatores que determinam a sua performance em relação ao pH. O xilano e os xilo-oligossacarídeos são polímeros de xilose e oligómeros com uma crescente variedade de aplicações. A maioria do xilano e xilo-oligossacarídeos estudados até à data são compostos por ligações β-1,4, e provém de plantas lignocelulósicas por processos caros, com múltiplas etapas, e prejudiciais ao ambiente. Ao tirar vantagem da ausência de lignina, do alto teor de xilano e de uma frágil parede celular da macroalga Palmaria palmata, conseguimos identificar e otimizar um eficiente sistema de biorrefinaria em cascata baseado em tecnologia “verde” de alto rendimento, para a produção sustentável de novos xilo-oligossacarídeos e xilano com ligações mistas β-1,3/β-1,4. Um pré-requisito necessário para o desenvolvimento de qualquer enzima aplicada a processos comerciais é compreender a sua atividade e estabilidade nas condições de processamento. Os nossos estudos aprofundados sobre a atividade, estabilidade e solubilidade desta xilanase, em função do pH, demonstraram que a precipitação proteica é o principal factor limitante, dominando praticamente todo o espectro de pH ácido e a pH alcalino próximo do seu pI. Na verdade, foram observados processos reversíveis na actividade a pHs ligeiramente acídicos, no entanto são rapidamente mascarados pela precipitação, enquanto que a pHs alcalinos, a precipitação é acompanhada por alterações da conformidade da enzima, seguido da completa desnaturação a pH alcalinos extremos. Estes conceitos demonstram a complexidade de factores que determinam a dependência das proteínas em relação ao pH e serão determinantes para melhorar a aplicabilidade desta enzima na indústria.

Xylanases (EC 3.2.1.8) are O-glycoside hydrolases which cleave the internal β-1,4-D-xylosidic linkages of the plant heteropolysaccharide xylan and are important industrial biocatalysts with widespread application. The present study was centred around a highly active cold-adapted glycoside hydrolase family 8 xylanase with the overall aim of developing its exploitation potential. The study encompassed both applied and fundamental research to enable an improved understanding and exploitation of the xylanase and thereby permit its expansion into new processes and products. Specifically, the use of the enzyme in the production of value-added products from a sustainable marine resource was developed and the factors determining its pH related performance characterised. Xylan and xylo-oligosaccharides are xylose polymers and oligomers with a growing variety of applications in diverse areas. Almost all xylan and xylo-oligosacharides studied to date have a β-1,4- linked backbone and have been isolated from land sourced lignocellulosic feedstocks via costly, multi-step, environmentally unfriendly processes. Taking advantage of the high xylan content, lignin free nature, weakly linked cell wall matrix and sustainability of the macroalgae Palmaria palmata, in combination with the high activity of the cold adapted xylanase, we identified and optimised an efficient, high yielding, scalable, green chemistry based cascading biorefinery system for the sustainable production of novel mixed linkage β-1,3/β-1,4 xylan and xylo-oligosaccharides. A prerequisite to the development of any enzyme for any commercial process is an understanding of its activity and stability under process conditions. Interestingly, little is known of the performance of the cold-adapted xylanase with respect to pH, a critical process parameter. Our in-depth study investigating the pH dependence of activity, stability and solubility in this xylanase identified protein precipitation as playing a major role, dominating over almost the entire acidic pH range and at alkaline pHs close to the pI. Reversible processes affecting activity are indeed initially observed at slightly acidic pHs, but are quickly overwhelmed by precipitation, while at alkaline pHs this is accompanied by conformational alterations, with complete protein unfolding being evident at alkaline pH extremes. Such insights highlight the complexity of factors determining the pH dependence of proteins and will be determinant in an improved application of this xylanase in industry as well as in its tailoring to specific process conditions.