Development of the caudal-most neural crest in the chick embryo

Abstract

The neural crest (NC) is a transient population of cells proper to vertebrate embryo that arises from the dorsal aspect of the neural tube (NT). Once specified by a distinct transcriptional program, induced by a combination of different signals emanating from surrounding tissues, NC cells (NCC) delaminate from the neuroepithelium. Then, they migrate into the periphery along stereotypical pathways and get specific localizations where they differentiate into a wide variety of cellular derivatives, according to their anteroposterior (AP) level of origin. For example, only cranial NCC give rise to cartilage and other mesenchymal derivatives, while sensory neurons and glia derive from the cephalic and trunk NC. Melanocytes are also formed in the NC at all the levels of the AP axis. An exception is the caudal-most NC issued from the extreme caudal tip of the NT and formed at embryonic day (E) 4 (HH24) at the level of somites 47 to 53 in the chick embryo. This one is characterized by a lack of neuronal derivatives. NCC issued from the caudal-most region of the NT give rise only to Schwann cells and melanocytes, but they do not have neuronal potential. In order to get insight about the mechanisms underlying this singular feature, we have performed a thorough analysis of the different steps of the NC ontogeny in this particular region as compared to other trunk regions. In the first part of our study, we have demonstrated that similar cellular and molecular mechanisms are operating during specification and delamination of NCC independently of the type of neurulation that leads to formation of the NT. For the first time, ontogeny of secondary NCC, arising at the prospective lumbo-sacral regions, was the subject of such analysis. By focusing our analyses on the caudal-most region of the embryo, we have found that few caudal-most NCC are generated at this region at E5/HH26. This does not seems to be a consequence of a general defect in the specification of this population of cells, taking place soon after full cavitation of the caudal-most NT at E4/HH24, but rather to an impairment of the mechanisms involved in their delamination from the neuroepithelium. In fact, we have ascertained an initial defective acquisition of the mesenchymal phenotype by these pre-migratory NCC that is associated with a perturbed BMP and WNT signaling in the dorsal aspect of the caudal-most NT. A spectacular pattern of apoptosis is also occurring in this region of the NT. Identification of migratory caudal-most NCC at E5/HH26 is coincident with the detection of full EMT in the dorsal aspect of the caudal-most NT. From heterotopic and heterochronic transplantation experiments of either the caudal-most NT or caudal-most somites into a rostral region, we have concluded that the lack of neuronal potential of caudal-most NCC is an intrinsic property of these cells and that somitic environment apparently has a reduced influence in this process. By the ectopic expression of Noggin in the trunk NT, we have reproduced the main features of the caudal-most NCC (scarcity of the cells and absence of neuronal derivatives), suggesting that Bmp4 likely constitutes one of the upstream signals of the mechanisms that finally culminate in the absence of sensory ganglia in this region of the embryo. Furthermore, our results stress out that a tightly coordinated mechanism regulates NCC delamination and subsequent steps of their differentiation, possibly involving a BMP threshold activity. We have finally evaluated the role of Bmp4 and of its target Wnt1 in directing neuronal specification of caudal-most NCC. Increased Bmp4 activity, by both electroporation of Bmp4 or knockdown of Noggin using miRNA, as well as increased Wnt1 activity in the caudal-most NT seems to generate more NCC derived from it. Further studies will be necessary to determine if this increase in the number of NCC is followed by DRG differentiation in the caudal-most region of the embryo. Formation of the caudal-most region of the embryo is coincident with the cessation of the embryonic axial elongation, a tightly regulated event that seems to involve several processes. In such a way, the scarcity of caudal-most NCC and their lack of neuronal derivatives may participate in this event. Therefore, our work about the mechanisms underlying the special features of caudal-most NCC would help to elucidate how AP axis formation stops in the embryo.

La crête neurale (CN) est une population de cellules transitoire, propre aux vertébrés qui dérive de la portion dorsale du tube neural (TN). Une fois spécifiées par un programme d’expression génique particulier induit par plusieurs signaux venant des tissus adjacents, les cellules de CN (CCN) effectuent une délamination à partir du neuroépithélium. Bientôt, ces cellules migrent vers la périphérie par des voies stéréotypées jusqu’à des localisations spécifiques où elles se différencient en plusieurs dérivés cellulaires, en fonction de leur niveau d’origine sur l’axe antéro-postérieur (AP). Par exemple, seules les CCN céphaliques donnent naissance à du cartilage ainsi qu’à d’autres dérivés de type mésenchymateux. Par contre, les neurones sensoriels et les cellules gliales du système nerveux périphérique se forment à partir de la CN céphalique et de la CN troncale. Des mélanocytes proviennent de tout le long de l’axe neural. La CN la plus caudale, issue de l’extrémité caudale du TN et formée pendant le 4e jour embryonnaire (E4) au niveau des somites 47 à 53 chez l’embryon de poulet, est caractérisée par l’absence de dérivés neuronaux. Les CCN de cette région ne donnent naissance qu’à des cellules de Schwann et à des mélanocytes. Afin d’élucider les causes de cette absence de dérivés neuronaux, nous avons entrepris une analyse détaillée des différentes étapes de la formation de la CN dans cette région de l’embryon d’oiseau. Nous avons commencé notre travail par une étude générale à propos de la formation de la CN « secondaire » en comparaison avec la CN « primaire ». Malgré des différences morphologiques évidentes dans le mode de formation du TN pendant la neurulation primaire (laquelle s’accomplit par la fermeture dorsale de la plaque neurale au niveau des régions céphalique et cervico-thoracique) et la neurulation secondaire (qui implique la cavitation du cordon médullaire au niveau lumbo-sacro-caudal), des CCN sont produites à partir de ces deux régions de l’axe troncal et elles génèrent des dérivés similaires, comme des mélanocytes, neurones et cellules gliales. Néanmoins, bien que la CN primaire ait été l’objet d’un grand nombre d’études, la CN secondaire a moins attiré l’attention et aucune donnée moléculaire à propos des différents aspects de sa formation n’étaient pas disponibles. C’est pourquoi, nous avons analysé, pendant la neurulation secondaire au niveau du tronc (somites 30 à 43), l’expression d’un grand nombre de molécules connuees pour êtres impliqués dans la spécification et la délamination des CNN primaires troncales. Nous avons effectué notre étude chez l’embryon de poulet aux stades 18 à 20 de Hamburger et Hamilton (1951) (18-20HH), pendant le 3e jour embryonnaire (E3). Nous nous sommes concentrés dans la région postérieure de ces embryons, notamment au niveau du mésoderme présomitique (MPS), des somites épithéliaux (SE) et des somites en début de dissociation (SD). Nous pouvons ainsi suivre les stades successifs de maturation de la CN selon une direction caudorostrale. Nous avons découvert que divers facteurs de transcription impliqués dans la spécification de la CN primaire troncale sont exprimés dans la région dorsale du TN secondaire peu après sa formation (cavitation complète). Des gènes comme Pax3, Pax7 et Snail2 (ex-Slug) sont détectés au niveau de la MPS postérieure alors que d’autres comme Msx1 et Msx2 sont exprimés au niveau de la MPS antérieure. De plus, une fois la spécification de la CN accomplie, des CCN en début de migration sont observées pour la première fois au niveau des 2e-3e derniers somites formés. Cette délamination des NCC secondaires, comme celle des NCC primaires, résulte d’événements cellulaires similaires à ceux d’une transition épithelio-mesenchyme (TEM). Cependant, RhoB, impliqué dans la régulation de ce processus, présente un patron d’expression particulier dans le TN secondaire, où il est accumulé du côté apical des cellules dorsales. Comme cette protéine de la famille GTPase semble entraîner des réorganisations du cytosquelette d’actine, nous avons été conduit à analyser la distribution de F-actine dans ce contexte. Nous avons trouvé que la forme des cellules dorsales du TN secondaire change une fois que l’émigration des CCN a eu lieu, comme le montre la perte d’accumulation de F-actine du côté basal des cellules dorsales du neuroépithelium. En plus, l’adhérence cellulaire est aussi modifiée au cours de la formation des CCN, une fois que les cellules dorsales du TN secondaire expriment Cad6B, Ncadherine et Cad7 d’une façon différentielle et dynamique. Tous ces changements sont aussi accompagnés d’une altération de l’interaction de ces cellules avec la matrice extracellulaire (MEC), comme il a été montré par la re-distribution de la forme activée de l’intégrine β1 au moment de la délamination des CCN. De plus, l’acquisition de motilité par les CCN secondaires coïncide avec une augmentation de l’activité de Bmp4, à la fois par un augmentation de ses transcrits et une diminution de l’expression de son inhibiteur Noggin, et l’expression de novo de Wnt1. Comme dans les régions plus antérieures issues de la neurulation primaire, ces événements sont en rapport avec la maturation des somites adjacents, puisque les premières CCN migratoires sont observées au niveau des SD. Globalement, notre analyse met en évidence pour la première fois les aspects moléculaires des différentes phases de la formation de la CN secondaire. En outre, les mécanismes impliqués dans ces phases semblent identiques tout au long du tronc de l’embryon, indépendamment du type de neurulation qui a amené à la formation du TN. Nous avons ensuite porté notre étude sur la région la plus caudale de l’embryon de poulet, située au niveau des somites 47 à 53 et formée à E4/HH24. Bien qu’une étude précédente ait montré que l’absence de dérivés neuronaux dans cette région ne soit pas due à une absence de CCN à ce niveau, des données moléculaires concernant la génération de ces CCN n’étaient pas disponibles. Ainsi, nous avons commencé par analyser la spécification des CCN les plus caudales. Nous avons observé que, aussi bien les marqueurs précoces (comme Pax3, Pax7 et Msx2), que les gènes spécifiques de la CN (tel que Snail2, FoxD3 et Sox9) sont exprimés dans le TN le plus caudal à E4/HH24, à l’exception de Msx1 qui n’a jamais été détecté. Néanmoins, nous n’avons jamais pu identifier des CCN migratoires à ce stade, même au niveau des somites en cours de différenciation. En effet, il a fallu attendre jusqu’à E5/HH26 pour détecter un nombre très restreint de CCN situées à proximité du TN caudal. De ce fait, un retard entre la spécification (à E4/HH24) et l’émigration (à E5/HH26) des CCN a lieu dans la région la plus caudale de l’embryon, accompagné d’un nombre réduit de cellules migratoires. Nos résultats à propos des phases subséquentes du développement de la CN suggèrent que le « décalage temporel » constaté résulte d’un défaut général dans la délamination des CCN les plus caudales. D’abord, nous avons trouvé que ces cellules n’acquièrent pas un phénotype mésenchymateux complet à E4/HH24. À ce stade, les CCN caudales « pré-migratoires » maintiennent la polarité apico-basale typique des cellules neuroépithéliales et la réorganisation du cytosquelette, par la re-distribution de F-actine, n’a pas lieu. Inversement, nous avons constaté que les propriétés d’adhésion cellulaire ainsi que celles de la MEC ne sont pas compromises. En plus, les voies de signalisation BMP et WNT sont perturbées dans le TN le plus caudal. Nous avons vu que Noggin est toujours exprimé dans la partie dorsale du TN caudal, malgré le fait que les somites adjacents sont déjà en cours de différentiation. Wnt1 n’a jamais été détecté à ce niveau. Néanmoins, quelques CCN arrivent à émigrer du neuroépithélium à E5. En même temps que les défauts de délamination des CCN caudales à E4/HH24, nous avons aussi découvert une apoptose massive tout au long de la moitié dorsale du TN caudal. Très probablement, cette apoptose participe au nombre réduit de CCN détecté dans la région la plus caudale. Un défaut de prolifération cellulaire semble aussi contribuer à cette caractéristique, étant donné que nous avons quantifié une réduction importante dans le pourcentage de cellules en phases S- et Mdu cycle cellulaire dans la région dorsale médiane du TN de E4/HH24 à E5/HH26. Pour juger de l’influence de l’environnement local et particulièrement de celle des somites dans les défauts de délamination des CCN les plus caudales, nous avons entrepris des expériences de transplantations ectopiques en utilisant la technique des chimères caillepoulet. Nous avons transplanté soit le TN caudal, soit les somites caudaux d’un embryon de caille au stade E4/HH24 dans une région plus rostrale d’un embryon de poulet au stade E2/HH11-12. Dans ces nouvelles conditions le TN caudal greffé ne forme pas de ganglions rachidiens (GR). Inversement, les somites caudaux ne bloquent pas la formation de GR à partir des CCN endogènes, bien que les GR qui sont générés alors sont plus petits, mal segmentés et situés plus dorsalement que les GR normaux. Ainsi, l’absence de potentiel neuronal des CCN les plus caudales est une propriété intrinsèque à ces cellules et l’environnement somitique semble avoir peu d’influence dans ce processus. En plus, les résultats que nous avons obtenus dans des expériences d’expression ectopique de Noggin dans le TN du tronc renforcent cette conclusion. Dans cette condition expérimentale, nous avons reproduit les principales caractéristiques du « phénotype » des CCN les plus caudales. En présence d’une faible concentration de Noggin, malgré l’existence de quelques CCN qui délaminent du TN electroporé, ces cellules ne forment pas de GR. Enfin, nous avons continué nos études fonctionnelles par l’évaluation de la contribution relative de Bmp4 et Wnt1 dans la formation de dérivés neuronaux. Pour cela, nous avons entrepris des expériences d’expression ectopique de ces gènes dans le TN caudal. Nous avons initié des électroporations de Bmp4 et de miRNA contre Noggin et Wnt1. Dans toutes ces situations, nous avons augmenté le nombre de CCN généré dans cette région. Cependant, nous n’avons pas encore déterminé si cette augmentation du nombre des cellules est suivie ou non de la génération de dérivés neuronaux dans la région la plus caudale de l’embryon. Notre étude de la formation des CCN secondaires et particulièrement de celles provenant de la région la plus caudale de l’embryon met en évidence, pour la première fois, les mécanismes sous-jacents à la pénurie de CCN ainsi qu’à l’absence des dérivés neuronaux qui caractérisent cette région singulière de l’embryon. Étant donné que la génération de la région la plus caudale coïncide avec la cessation d’élongation axiale de l’embryon, les résultats obtenus par notre étude contribueront à une meilleure compréhension de l’arrêt de la formation de l’axe AP de l’embryon.

A crista neural (CN) é uma estrutura embrionária transitória, composta por uma população de células característica dos vertebrados, que se forma a partir da região dorsal do tubo neural (TN). A especificação destas células resulta da expressão de um conjunto particular de genes, induzidos por sinais provenientes dos tecidos adjacentes. Uma vez especificadas, as células da CN (CCN) destacam-se do TN e migram para diversas regiões do embrião, segundo trajectos extremamente precisos. Quando chegam aos seus locais de destino, as CCN diferenciam-se em múltiplos tipos celulares, contribuindo para a formação de diversas estruturas, de acordo com a sua origem no eixo antero-posterior (AP) do embrião. Assim, apenas as CCN da região craniana formam cartilagem e outros derivados mesênquimatos da face, enquanto que os neurónios e as células gliais do sistema nervoso periférico derivam de CCN das regiões craniana e troncal. Os melanócitos formam-se a partir das CCN que migram ao longo de todo o eixo antero-posterior do TN. A CN mais caudal, que no embrião de galinha se forma durante o 4° dia de desenvolvimento embrionário (E4) ao nível dos sómitos 47 a 53, caracteriza-se pela ausência de derivados neuronais. As CCN desta região do embrião só se diferenciam em células de Schwann e melanócitos. Para elucidarmos as causas da ausência de derivados neuronais, fizemos uma análise detalhada das diferentes etapas que conduzem à formação de CCN na região mais caudal do embrião de galinha. Na primeira parte do nosso trabalho, realizamos um estudo comparativo entre a formação da CN “secundária” e a NC “primária”. Apesar das diferenças morfológicas evidentes no mecanismo de formação do TN durante a neurulação primária (em que o tubo neural se forma através da fusão dorsal das extremidades da placa neural, nas regiões craniana e cervico-torácica) e a neurulação secundária (em que o tubo neural se forma por cavitação da corda medular, ao nível lumbo-sacro-caudal), as CCN que se formam em ambas as regiões do tronco originam derivados semelhantes, tais como melanócitos, neurónios e células gliais. A CN primária tem sido objecto de estudo de um grande número de trabalhos; no entanto, o mesmo não se verifica em relação à CN secundária, sobre a qual são inexistentes dados moleculares relativos às diversas etapas da sua formação. Por esta razão, nós estudamos, ao nível da neurulação secundária (sómitos 30 a 43), a expressão de um número importante de genes responsáveis pela especificação e delaminação das CCN da neurulação primária. O nosso estudo foi realizado em embriões de galinha, durante o 3° dia de desenvolvimento embrionário (estadio 18-20 de Hamburger e Hamilton (HH)). Em primeiro lugar, focamos a nossa análise na região posterior do embrião, ao nível dos somitos 30 a 43, i.e., aquela que contém o TN posterior flanqueado pela mesoderme presomítica (PSM), sómitos epiteliais (SE) e sómitos em início de diferenciação (SED). Desta forma, estudamos estadios sucessivos de maturação da CN segundo uma sequência caudo-rostral. Os resultados obtidos mostram que muitos dos factores de transcripção implicados na especificação da CN primária troncal também são expressos na região dorsal do TN secundário, i.e., formado por cavitação. Genes como Pax3, Pax7 e Snail2 (ex-Slug) são detectados ao nível da PSM posterior enquanto que outros como Msx1 e Msx2 são expressos ao nível da PSM anterior. Após especificação, as CCN secundária em face do 2°-3° últimos sómitos formados delaminam e, tal como a das NCC primária, sofrem eventos celulares idênticos aos de qualquer transição epitelio-mesênquima (TEM). No entanto, RhoB, molécula proposta como responsável pela reorganização do citosqueleto de actina, apresenta um padrão de expressão particular no TN secundário, onde se encontra acumulado no lado apical das células dorsais do TN. Por este facto, analisamos a distribuição da F-actina no TN secundário e observamos que as células da sua CN apresentam morfologia mesênquimatosa, não acumulam F-actina no seu lado basal e emigram. Constatamos igualmente modificações na aderência celular ao longo da formação das CCN, uma vez que as células dorsais do TN secundário exprimem, de forma especifica e dinâmica, Cad6B, N-cadherin e Cad7. Estas alterações na forma e na aderência celular são acompanhadas por mudanças na interacção entre estas as CCN e a matriz extracelular (MEC), como demonstrado pela re-distribuição da forma activa da integrina β1 nestas células, concordante com a sua delaminação. A aquisição de motilidade por parte das CCN secundárias coincide com o aumento da actividade de Bmp4, quer devido ao aumento dos seus transcriptos, quer à diminuição da expressão do seu antagonista Noggin e à expressão de novo de Wnt1. Tal como durante a neurulação primária, estes eventos estão relacionados com a maturação dos sómitos adjacentes, uma vez que as primeiras CCN a migrar são detectadas ao nível dos SED. Esta nossa análise mostra, pela primeira vez, os aspectos moleculares das diferentes fases de formação da CN secundária. Os mecanismos envolvidos nestas fases parecem ser idênticos ao longo do eixo antero-posterior da região troncal do embrião, independentemente do tipo de neurulação que deu origem ao TN. Em segundo lugar, o nosso estudo incidiu sobre a região mais caudal do embrião, localizada ao nível dos sómitos 47 a 53 e formada no quarto dia de desenvolvimento. Um estudo precedente ao nosso mostrou que a ausência de derivados neuronais nesta região não é devido a uma ausência total de CCN. No entanto, nenhuns dados moleculares relativos a formação destas células estavam disponíveis. Assim, começamos por analisar a especificação das CCN mais caudais, constatando que quer os marcadores precoces (Pax3, Pax7 e Msx2) quer os marcadores específicos da NC (Snail2, FoxD3 e Sox9) são todos expressos no NT mais caudal a E4/HH24, excepto Msx1 que nunca foi detectado. No entanto, não conseguimos visualizar NCC a este estadio, mesmo ao nível dos sómitos que começaram a diferenciar-se. Foi necessário “esperarmos” até E5/HH26 para detectarmos algumas CCN próximas do TN, concluindo que, na região mais caudal do embrião, ocorre uma diminuição no número de CCN que emigram e um atraso entre a sua especificação (a E4/HH24) e a sua emigração (a E5/HH26). Os nossos resultados sobre as etapas subsequentes do desenvolvimento da CN sugerem que este atraso resulta de um defeito geral na delaminação das CCN mais caudais. Em primeiro lugar, observamos que CCN não adquirem um fénotipo mesenquimatoso completo a E4/HH24. Neste estadio, as CCN caudais “pré-migratórias” mantêm a polaridade apico-basal típica das células neuroepiteliais e não re-organizam o citosqueleto, o que é visualizado pela distribuição de F-actina. No entanto, as propriedades de aderência celular, assim como as da MEC, não estão comprometidas. Para além disto, as vias de sinalização BMP e WNT estão afectadas no NT dorsal. Vimos que a expressão de Noggin é mantida e que Wnt1 nunca é presente a este nível, apesar dos sómitos adjacentes estarem a diferenciar-se. No entanto, algumas células emigram desta região a E5/HH26. Concomitantemente com estes defeitos de delaminação das CCN mais caudais a E4/HH24, nós também descobrimos um apoptose massiva ao longo da metade dorsal do TN caudal. Muito provavelmente, esta apoptose contribui para o número reduzido de CCN observado nesta região. Um defeito de proliferação celular poderá também contribuir para esta característica, uma vez que observamos uma redução importante na percentagem de células em fase S- e M- do ciclo celular, na região mediana do TN, de E4/HH24 a E5/HH26. De modo a avaliar a influência do ambiente caudal, e mais precisamente do ambiente somítico, nos defeitos de delaminação das CCN mais caudais, realizamos experiências de transplantação ectópica, utilisando a técnica de quimeras galinha-cordoniz. Nós transplantamos ora o TN caudal ora os sómitos caudais de um embrião de cordoniz no estadio E4/HH24 para uma região mais anterior de um embrião de galinha no estadio E2/HH12-12. Mesmo nestas condições, não se formou nenhum gânglio raquidiano a partir do TN transplantado. Inversamente, os sómitos caudais não impedem a formação de gânglios raquidianos (DRG) a partir das NCC endógenas, ainda que estes sejam mais pequenos, mal segmentados e situados mais dorsalmente que os outros DRG. Assim, estas experiências mostram que a ausência de potencial neuronal das NCC mais caudais é uma propriedade intrínseca a estas células e que o ambiente somítico parece ter pouca influência neste processo. Os resultados que obtivemos nas experiências de expressão éctopica de Noggin no TN troncal reforçam esta conclusão. Nesta condição experimental, reproduzimos o “fénotipo” das CCN mais caudais. Na presença de uma baixa concentração de Noggin, apesar de existirem algumas NCC que delaminaram do NT electroporado, estas células não formam DRG. Para determinar o papel desempenhado por Bmp4 e Wnt1 na formação de derivados neuronais, vectores de expressão contendo sequências genómicas de Bmp4, miRNA contra Noggin ou Wnt1 foram electroporados no TN mais caudal. Em todas estas situações experimentais, observamos um aumento no número de CCN que se formam nesta região. No entanto, ainda não conseguimos determinar se este aumento do número de CCN é seguido da formação de derivados neuronais na região mais caudal do embrião. Em suma, o nosso estudo sobre a formação das CCN secundárias, particularmente as que derivam da região mais caudal do embrião, evidencia, pela primeira vez, os mecanismos que conduzem à redução do número de CCN e à ausência de potencial neuronal que caracteriza estas células. Uma vez que a formação da região mais caudal do embrião coincide com a cessação do seu elongamento axial, os nossos resultados poderão contribuir para uma melhor compreenssão sobre os mecanismos que levam à paragem do crescimento AP do embrião.