Novel insights on the interaction of lactoferrin with proton pumping ATPases towards understanding its antifungal and anticancer activities

Abstract

Lactoferrin (Lf) is a naturally occurring iron-binding protein and one of the most well-known milk bioactive compounds. In addition to milk, it is also found in different fluids of mammals including several mucosal surfaces. A multitude of biological activities, such as antimicrobial, antiviral, immunomodulatory and anticancer, have been ascribed to this protein, revealing its multifunctional character. Among them, its antifungal and anticancer activities stand out, as toxicity against a wide collection of yeasts and filamentous fungi, and a broad range of cancer types has been demonstrated. However, the molecular mechanisms underlying these activities are still poorly elucidated, which limits Lf applications as an anticancer and antifungal agent. In the present thesis, we sought to improve the current knowledge on the mechanisms through which Lf exerts its cytotoxicity against fungal and cancer cells, aiming to contribute to its rational, targeted and more efficient application. Since previous studies have identified proton pumping ATPases as Lf molecular targets, we focused on exploring the interaction between Lf and these proton pumps, as well as on the consequences of these interactions. A combination of biochemical, genetic and computational approaches was employed to attain the envisioned goals. Our work revealed a novel effect of bovine Lf (bLf) against yeast, that was further validated in cancer cells, through perturbation of ergosterol/cholesterol-rich lipid rafts, membrane microdomains that function as platforms for signalling and protein trafficking. These results reinforced the advantages of using yeast as a simple unicellular eukaryotic complementary model to elucidate the mechanisms underlying the anticancer activity of Lf. These alterations were intimately related with the bLf inhibitory effect towards the proton pump Pma1p in yeast, and V-ATPase in both yeast and cancer cells. Specifically, we found that lipid rafts composition, as well as Pma1p-lipid rafts association are critical for bLf yeast killing activity. Regarding bLf anticancer activity, we showed that bLf-driven lipid rafts disruption is associated with cellular trafficking perturbations, downregulation of components of the PI3K/AKT signalling pathway and inhibition of glycolysis. The computational approach herein developed allowed to predict a mechanism of Lf-induced V-ATPase inhibition, and to identify critical residues for their interaction. Altogether, the work developed in this thesis uncovered novel cellular and molecular events triggered by Lf in the context of its antifungal and anticancer activities that have great potential to pave the way for future Lf-based applications.

A lactoferrina (Lf) é uma proteína natural que se liga a ferro e um dos compostos bioativos do leite mais conhecidos. A Lf está também presente em diferentes fluidos de mamíferos incluindo em várias mucosas. Diversas atividades biológicas, como antimicrobiana, antiviral, imuno-moduladora e anticancerígena têm sido atribuídas à Lf, revelando o seu caráter multifuncional. Destas, destacam-se as suas atividades antifúngica e anticancerígena que já foram demonstradas contra várias espécies de leveduras e fungos filamentosos, bem como contra vários tipos de cancro, respetivamente. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a essas atividades são ainda pouco conhecidos, limitando as aplicações da Lf como agente antifúngico e anticancerígeno. Na presente tese, pretendemos melhorar o conhecimento dos mecanismos pelos quais a Lf exerce citotoxicidade contra fungos e células de cancro, e assim contribuir para sua aplicação mais racional, direcionada e eficiente. Dado que estudos anteriores identificaram as bombas de protões ATPases como alvos moleculares da Lf, focámos o nosso trabalho na interação entre a Lf e estas bombas bem como nas suas consequências. Usámos uma combinação de abordagens bioquímicas, genéticas e computacionais para atingir os objetivos propostos. Os resultados revelaram um novo efeito de Lf bovina (bLf) que consiste na perturbação de microdomínios lipídicos ricos em ergosterol/colesterol, os quais funcionam como plataformas para sinalização e tráfego de proteínas. Estes resultados reforçam o uso da levedura como modelo unicelular eucariota complementar para elucidar os mecanismos subjacentes à atividade anticancerígena da Lf. Essas alterações estão relacionadas com o efeito inibidor da Lf sobre as bombas de protões Pma1p da levedura e V-ATPase da levedura e de células de cancro. Especificamente, descobrimos que a composição dos microdomínios lipídicos, bem como a associação destes com a Pma1p, são críticas para a atividade da bLf contra leveduras. Relativamente à sua atividade anticancerígena, demonstrámos que a perturbação dos microdomínios lipídicos induzida pela bLf está associada a perturbações de tráfego celular, a diminuição da expressão de componentes da via de sinalização PI3K/AKT e a inibição da glicólise. Por fim, a abordagem computacional aqui desenvolvida permitiu prever o mecanismo pelo qual a Lf inibe a V-ATPase e identificar resíduos críticos para esta interação. Resumindo, este trabalho permitiu avançar o conhecimento sobre os eventos celulares e moleculares desencadeados pela Lf no contexto das suas atividades antifúngica e anticancerígena com potencial para abrir caminho para futuras aplicações da Lf.