S. epidermidis putative toxin-antitoxin module mazEF: the role in VBNC formation and impact on the immune system

Abstract

Staphylococcus epidermidis é um microrganismo comensal que habita na pele e membranas mucosas dos seres humanos e outros mamíferos, mas que pode atuar como um agente patogénico oportunista, especialmente em pacientes imunocomprometidos e em bebés prematuros. Os principais fatores de virulência de S. epidermidis são a sua reduzida suscetibilidade a antibióticos e a sua capacidade de formação de biofilmes e de evasão à resposta do sistema imunitário. Os biofilmes estão também associados à recorrência de infeções, o que pode estar relacionado com a presença de células viáveis mas não-cultiváveis (CVNC) na sua composição. Um anterior estudo identificou o operão mazEF, descrito como um potencial sistema toxina-antitoxina (TA), como um possível regulador da ocorrência de CVNC em biofilmes de S. epidermidis. De forma a determinar o papel do mazEF na modulação do estado CVNC e o seu impacto noutros aspetos de virulência, construímos e caracterizamos duas estirpes mutantes sem o operão mazEF. Um modelo in vitro previamente desenvolvido para modular a indução do estado CVNC em biofilmes foi validado com as nossas estirpes e conseguimos também induzir a formação de células CVNC em culturas planctónicas, sendo este fenómeno de alguma forma regulado pela densidade celular. Surpreendentemente, ao compararmos a estirpe mutante de mazEF com a estirpe selvagem, não foram encontradas diferenças na indução do estado CVNC quer em biofilmes, quer em culturas planctónicas. Uma vez que homólogos do operão mazEF foram identificados como sistemas TA, os mutantes foram complementados com outro plasmídeo onde a expressão do mazEF foi regulada por um promotor induzível, permitindo assim determinar se a indução da toxina levaria à morte celular. Contudo, sob as condições experimentais utilizadas, a expressão destes genes não levou à morte celular, sugerindo, assim, que o homólogo de mazEF não funciona como um sistema TA nas estirpes testadas. Estudámos também o impacto do mazEF noutras características de virulência, incluindo a sobrevivência a antibióticos ou à ação bactericida do sangue e plasma humanos e a resposta de células dendríticas e macrófagos a infeções com as estirpes de S. epidermidis 1457. Dos fatores testados, apenas uma menor suscetibilidade à rifampicina e uma atividade metabólica distinta após tratamento com tetraciclina foram observados no mutante, levando-nos a concluir que o homólogo de mazEF tem um impacto pouco significativo no potencial de virulência das estirpes de S. epidermidis aqui usadas.

Staphylococcus epidermidis is a commensal microorganism that inhabits the skin and mucous membranes of humans and several mammals, but acts as an opportunistic pathogen, particularly in immunocompromised patients and neonates. The main virulent properties of S. epidermidis are its reduced antimicrobial susceptibility profile, associated with biofilm formation ability, which contribute to the evasion from the host immune response. Biofilms have also been associated with recurrent infections, and this might be due to the high proportion of viable but non-culturable (VBNC) cells within them. A previous RNA-Seq study identified the mazEF putative toxin-antitoxin (TA) system as a possible key player in the regulation of the occurrence of VBNC cells in S. epidermidis biofilms. In order to determine the role of mazEF in the modulation of the VBNC state and its impact on other virulence aspects of biofilms, we constructed and characterized two mutant strains lacking the mazEF operon. The previously characterized in vitro model used to modulate VBNC induction in biofilm cultures was further validated and we demonstrated that VBNC induction can also occur in planktonic cultures, being this phenomenon somewhat related to cellular densities. Surprisingly, when comparing the mazEF operon mutant to the wild-type strain, no significant differences were observed in VBNC induction in either biofilms or planktonic cultures. As mazEF homologues have also been identified as TA systems, the mutants were complemented with a different plasmid, wherein the mazEF expression was regulated by an inducible promoter, in order to determine if the induction of the toxin module would lead to bacterial death. However, under our experimental conditions, neither gene expression led to bacterial death, suggesting that the mazEF homologue was not acting as a TA system in our strains. We also assessed the impact of mazEF in other relevant virulence characteristics, including the ability to survive after antibiotic challenges or in human blood and plasma, and the response of dendritic cells and macrophages to infections with S. epidermidis 1457 strains. Of the tested traits, only a lower susceptibility to rifampicin and a distinct metabolic activity upon treatment with tetracycline was observed in the mutant strain, leading us to conclude that the mazEF homologue operon had a minor impact on virulence of the S. epidermidis strains considered herein.