Resveratrol de novo biosynthesis from lignocellulosic biomass: metabolic engineering of thermotolerant robust yeast strains for an integrated and intensified process

Abstract

Microrganismos robustos são essenciais para desenvolver processos sustentáveis e industrialmente atrativos. A levedura Saccharomyces cerevisiae é amplamente utilizada como fábrica celular para produzir biocombustíveis e outros bioprodutos de alto valor, sendo as estirpes industriais conhecidas pela sua elevada capacidade fermentativa e aptidão para lidar com condições adversas (p.e. altas temperaturas, baixo pH). O resveratrol é um composto polifenólico antioxidante, geralmente extraído de plantas ou sintetizado quimicamente, processos considerados complexos e não sustentáveis. A sua biossíntese pode ser uma alternativa valiosa para compensar estes inconvenientes, embora seja geralmente obtida à custa de substratos dispendiosos como o ácido p-cumárico. A produção de novo de resveratrol a partir de fontes de carbono pode, portanto, ser crucial para ultrapassar estes obstáculos. Nesta tese, várias estirpes industriais de S. cerevisiae foram geneticamente modificadas através de CRISPR/Cas9 com uma via biossintética de resveratrol (VBR). Após avaliação das estirpes recombinantes em fermentação até 39 ⁰C, a estirpe mais termotolerante (Ethanol Red) foi aplicada na produção de resveratrol por Sacarificação e Fermentação Simultâneas de madeira de eucalipto pré-tratada hidrotermicamente, sendo obtida uma concentração de 152 mg/L. Depois, a utilização de lactose foi viabilizada pela expressão heteróloga de uma permease de lactose e de uma β-galactosidase. A estirpe resultante metabolizou eficientemente altas concentrações de lactose e, após a otimização das condições de oxigenação, foi atingido um título de 284 mg/L de resveratrol. Esta estirpe foi igualmente capaz de produzir resveratrol a partir de soro de queijo. A VBR foi também expressa numa estirpe Ethanol Red que metaboliza xilose, com os genes da fase não-oxidativa da via das pentoses fosfato sobre-expressos, melhorando o fornecimento de precursores da VBR. Após otimização da atividade do citocromo P450 e da suplementação do meio, esta estirpe produziu 224 mg/L de resveratrol a partir da xilose. A cofermentação simultânea de glucose e xilose levou a um título de resveratrol de 388 mg/L, 1,35 vezes maior do que em glucose para a mesma molaridade total de carbono. Esta estirpe foi utilizada para a produção de resveratrol na valorização de resíduos da indústria vinícola como o resíduo de poda da vinha (glucose/xilose), o mosto de uva (glucose/frutose) e as borras de vinho (etanol). Os resultados aqui apresentados contribuem para alargar a aplicação do conceito de biorrefinaria, baseada em resíduos agroindustriais, na produção de compostos-alvo de maior valor, destacando o papel da S. cerevisiae no desenvolvimento de bioprocessos mais ecológicos, seguindo o conceito de bioeconomia circular.

Robust microorganisms are essential to develop sustainable and industrially attractive processes. The yeast Saccharomyces cerevisiae is widely used as a cell factory to produce biofuels and other high-value natural products, industrial strains being known for their high fermentative capacity and ability to cope with harsh conditions (e.g. high temperatures, low pH). Resveratrol is an antioxidant polyphenolic compound, generally extracted from plants or chemically synthesised, both processes considered complex and non-sustainable. Its biosynthesis can be a valuable alternative to offset these drawbacks, though it is generally achieved at the cost of expensive substrates like p-coumaric acid. De novo resveratrol production from carbon sources can, therefore, be crucial to overcome these hindrances. In this thesis, a set of robust industrial yeast strains, known for their excellent fermentative performance, was engineered via the CRISPR/Cas9 system with a resveratrol biosynthetic pathway (RBP). After screening the recombinant strains in fermentation up to 39 ⁰C, the most thermotolerant yeast strain, an Ethanol Red-derivative, was applied for resveratrol production by Simultaneous Saccharification and Fermentation of hydrothermally pretreated eucalyptus wood, achieving a titre of 152 mg/L. Subsequently, lactose utilisation was enabled by the heterologous expression of a lactose permease and a β- galactosidase. The resultant strain was able to efficiently metabolise a high concentration of lactose and, after fine-tuning the oxygenation conditions, 284 mg/L of resveratrol was attained. This strain was also capable of producing resveratrol using exclusively cheese whey as a substrate. The RBP was also expressed in a xylose-consuming Ethanol Red strain, with an overexpression of the non-oxidative pentose phosphate pathway genes, improving the precursor supply of the RBP. After enhancing the cytochrome P450 activity and optimising the supplementation of the media, this strain was able to produce 224 mg/L of resveratrol from xylose. Simultaneous co-fermentation of glucose and xylose led to a resveratrol titre of 388 mg/L, 1.35-fold higher than in glucose alone with the same total carbon molarity. This strain was used for the valorisation of agro-industrial wastes from the wine industry, a source of several fermentable sugars, namely glucose and xylose (vine pruning residue), glucose and fructose (grape must) and ethanol (wine lees). Altogether, the results displayed in this thesis contribute to the expansion of possible target chemicals for a biorefinery based on different agro-industrial by-products, highlighting the role of robust industrial S. cerevisiae strains for the establishment of greener bioprocesses following the circular bioeconomy concept.