Substratos peptídicos da Granzyme B como sondas fluorescentes: estudos de FRET para aplicação num sistema de libertação controlada de fármacos para o cancro colorretal

Abstract

O cancro colorretal (CCR) é o terceiro tipo de tumor maligno mais diagnosticado em todo o mundo. As opções atuais de tratamento focam-se na eliminação direta das células cancerígenas, mas carecem de especificidade que se traduz em danos graves nos tecidos saudáveis. Uma potencial alternativa terapêutica é a imunoterapia, isto é, os fármacos atuam especificamente no sistema imunológico do paciente, em vez de eliminar as células tumorais diretamente. A nanotecnologia pode desempenhar um papel crucial nesta estratégia, ajudando na libertação de fármacos imunoestimulantes no microambiente tumoral. O Imiquimod é um fármaco imunoestimulante que tem como alvos principais as células imunes T CD8 + e NK (Natural Killers). Quando estas células são ativadas, libertam compostos que levam à morte celular. A Granzyme B (GzmB) é uma serina protease envolvida num dos dois mecanismos dominantes pelos quais essas células medeiam a morte de células cancerígenas. O objetivo deste trabalho consistiu na síntese e caraterização de sondas fluorescentes para a GzmB, utilizando um fluoróforo (Edans) e um quencher (Dabcyl) ligados a uma sequência específica para esta enzima (Ala-Ala-Asp), com um aminoácido adicional como ponto de ancoragem (Lys). Estas sondas servem como prova de conceito de um projeto que tem como objetivo aplicar sondas fluorescentes mais complexas para a GzmB e através de técnica baseadas em FRET para monitorizar um sistema de libertação controlada de fármacos imunoestimulantes utilizado no tratamento do cancro colorretal. Os péptidos foram sintetizados com os grupos laterais amino e ácido carboxílico da Lys e Asp, protegidos com o grupo Boc e tBu, respetivamente, e foram obtidos por síntese peptídica em fase sólida assistida por micro-ondas, aplicando a estratégia Fmoc e uma resina de cloreto de 2- clorotritilo. A ligação do par FRET Edans/Dabcyl foi realizada por síntese em fase sólida e em solução. As sondas obtidas foram purificadas por HPLC semi-preparativo e caraterizadas por espetroscopia de RMN de 1H, de 13C e bidimensional (HMBC e HMQC), por espetroscopia de absorção UV/Vis e de fluorescência. Foram realizados também estudos de FRET em solução, em que se avaliou o quenching intermolecular de fluorescência do Edans com o Dabcyl. Foram ainda realizadas sínteses para obter intermediários de cianina do tipo 5 (Cy5) e de Black Hole Quencher 3 (BHQ-3), como par FRET mais indicado para estudos celulares.

Colorectal cancer (CRC) is the third most diagnosed malignant tumor type worldwide. Current treatment options are focused on the direct depletion of cancer cells, but lack specificity that translates into severe damage to healthy tissues. A potential therapeutic alternative is immunotherapy, that is, drugs act specifically on the patient's immune system rather than directly eliminating tumor cells. Nanotechnology can play a crucial role in this strategy, helping deliver immunostimulating drugs to the tumor microenvironment. Imiquimod is an immunostimulating drug that has as main targets CD8+ T and NK (Natural Killers) immune cells. When these cells are activated, they release compounds responsable for cell death. Granzyme B (GzmB) is a serine-protease involved in one of the two dominant mechanisms by which these cells mediate cancer cell death. The aim of this work was the synthesis and characterization of fluorescent probes for GzmB using a fluorophore (Edans) and a quencher (Dabcyl) linked to a specific sequence for this enzyme (Ala-Ala-Asp), with an additional amino acid as anchoring point (Lys). These probes serve as proof of concept for a project that aims to apply more complex fluorescent probes for GzmB and by applying FRET-based techniques to monitor a controlled release system of immunostimulanting drugs used in the treatment of colorectal cancer. The peptides were synthesized with the side chain amino and acid groups of Lys and Asp, protected with the Boc and tBu group, respectively, and the peptides were obtained by microwave assisted solid phase peptide synthesis, applying the Fmoc strategy and a 2-chlorotritylchloride resin. The linking of the FRET Edans/Dabcyl pair was performed by solid phase and solution synthesis. The obtained probes were purified by semi-preparative HPLC and characterized by 1H, 13C and two-dimensional NMR spectroscopy (HMBC and HMQC), UV/Vis absorption and fluorescence spectroscopy. Solution FRET studies were also performed, in which the intermolecular fluorescence quenching of Edans with Dabcyl was evaluated. Furthermore, syntheses were performed to obtain cyanine type 5 (Cy5) and Black Hole Quencher 3 (BHQ-3) intermediates, as a more suitable FRET pair for cellular assays.