Characterization of Hippo signalling pathway in chick lung development

Abstract

HIPPO signalling pathway, and its effector YAP, have been recognized as important growth regulators during embryonic development, adult tissue regeneration, homeostasis, and tumorigenesis. YAP phosphorylation status impacts the transcription of HIPPO target genes responsible for conveying HIPPO response. Curiously, the inhibition of this pathway in the liver causes overgrowth, whereas in pancreas hypoplasia, therefore suggesting phenotypic differences depending on the organ system. Nevertheless, the information regarding pulmonary development remains limited. Therefore, this project aims to determine HIPPO’s role during pulmonary branching and, for the first time, in the avian animal model. All experiments were conducted in embryonic chick lungs during early branching stages. The spatial distribution of HIPPO signalling members was characterized by in situ hybridization. Moreover, in vitro lung explant culture was performed for 48 hours, and protein levels of phosphorylated-YAP (pYAP)/YAP were evaluated by Western blot at two time-points (0 and 48 hours). Additionally, lung explants were cultured with verteporfin (VP) (5, 7.5 and 10 µM), which prevents YAP-TEAD binding, resulting in supressed transcription of target genes (ctgf). Subsequently, explants were also subjected to in situ hybridization for ctgf, to confirm successful HIPPO modulation. In addition, explants were morphometrically analysed to determine the impact of Hippo modulation on lung growth. Finally, lung explants were evaluated for cytotoxicity by LDH assay. In situ hybridization revealed that all HIPPO signalling members are present in the developing lung, throughout early stages of chick lung branching, except for mst2 and lats2. The western blot analysis revealed similar expression levels of both YAP and pYAP in the three stages studied. After 48 hours in culture, YAP and pYAP protein levels were slightly decreased when compared to 0 hours, nonetheless, the pYAP/YAP ratio was maintained. Lung explants treated with 7.5 and 10 µM of VP displayed statistically significant overall reduction in lung size, when compared to controls. VP-treated lung explants displayed a decrease in ctgf expression, in a dose-dependent manner, thus confirming alteration in HIPPO signalling. Lastly, the LDH assay revealed no cellular toxicity in all verteporfin conditions. This study demonstrates, for the first time, the presence of HIPPO signalling in early stages of avian pulmonary branching. Gene/protein expression profile and pathway modulation studies indicate that HIPPO is active and possibly involved in lung growth control.

A via de sinalização HIPPO, e seu efetor YAP, têm um papel importante na regulação do crescimento durante o desenvolvimento embrionário, regeneração de tecidos no adulto, homeostasia e tumorigénese. O estado de fosforilação da proteína YAP tem impacto na transcrição de genes alvo específicos, responsáveis por transmitir a resposta da via. Curiosamente, a inibição da via HIPPO no fígado causa crescimento, enquanto no pâncreas induz hipoplasia, sugerindo diferenças fenotípicas dependendo do órgão. No entanto, a informação disponível sobre o desenvolvimento pulmonar é ainda limitada. Assim, este projeto como objetivo determinar o papel da via HIPPO durante a ramificação pulmonar e, pela primeira vez, no modelo de galinha. Neste sentido, utilizaram-se pulmões embrionários de galinha nos estadios iniciais de ramificação. O padrão de expressão dos componentes da via HIPPO foi caracterizado por hibridização in situ. Paralelamente, realizaram-se cultura de explantes pulmonares in vitro, durante 48 horas, e os níveis proteicos de YAP e YAP fosforilado (pYAP) foram avaliados por Western blot às 0 e 48 horas. Mais ainda, os explantes pulmonares foram tratados com verteporfina (5, 7,5 e 10 µM) que impede a ligação de YAP TEAD resultando na supressão da transcrição de genes alvo (ctgf). Subsequentemente, os explantes foram analisados por hibridação in situ para ctgf, para confirmar a modulação da via HIPPO. Os explantes foram também analisados morfometricamente para determinar o impacto da modulação desta via no crescimento pulmonar. Finalmente, os explantes pulmonares foram avaliados quanto à citotoxicidade pelo ensaio de LDH. A hibridização in situ revelou que todos os componentes da via HIPPO estão presentes no pulmão em desenvolvimento, nos estadios iniciais da ramificação do pulmão de galinha, com exceção de mst2 e lats2. Por outro lado, a análise de Western blot revelou níveis de expressão semelhantes de YAP e pYAP nos estadios estudados. Após 48 horas, os níveis de proteína YAP e pYAP diminuíram quando comparados a 0 horas, no entanto, a relação pYAP/YAP manteve-se constante. Os explantes de pulmão tratados com 7,5 e 10 µM de verteporfina (VP) apresentaram uma redução global, e estatisticamente significativa, no tamanho do pulmão, quando comparados com o controlo. Os explantes de pulmão tratados com verteporfina exibiram uma diminuição na expressão de ctgf, dependente da dose, confirmando assim a alteração na sinalização de HIPPO. Por fim, o ensaio de LDH não revelou toxicidade celular nas condições de verteporfina testadas. Este estudo demonstra, pela primeira vez, a presença da via de sinalização de HIPPO nos estadios iniciais da ramificação pulmonar de galinha. O perfil de expressão bem como os estudos de modulação da via sugerem que a via HIPPO está ativa e possivelmente envolvida no controlo do crescimento pulmonar, em galinha.