New method for monitoring the progression of cell death

Abstract

O equilíbrio entre a divisão celular e a morte celular é extremamente importante para o desenvolvimento e manutenção de organismos multicelulares. A proliferação celular descontrolada pode resultar no desenvolvimento de tumores, ao passo que um nível excessivo de morte celular pode resultar em doenças neurodegenerativas como Alzheimer e Parkinson. No último século, as leveduras têm servido como ferramenta para a investigação, inclusive no estudo da morte celular. Além de ser o organismo eucariótico mais estudado, contribuiu para o conhecimento atual de diversos mecanismos celulares conservados entre a espécie humana e as leveduras. O ácido acético e o peróxido de hidrogénio estão entre os agentes mais comummente descritos como indutores de um fenótipo apoptótico em leveduras, associado à perda de viabilidade, sem perda da integridade da membrana plasmática. A integridade da membrana plasmática é normalmente avaliada durante a exposição das células a um estímulo e a viabilidade celular apenas alguns dias após o plaqueamento dessas células. Portanto, o número de células com integridade da membrana plasmática e as contagens de unidades formadores de colónias (CFUs) nem sempre se correlacionam num cenário apoptótico. Uma vez que a morte celular ocorre apenas após a quebra irreversível da membrana plasmática, são necessários novos métodos para correlacionar melhor essas características. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi desenvolver um método simples, capaz de explorar em que ponto, após um estímulo apoptótico e plaqueamento de células, estas morrem, em consequência de rutura da membrana plasmática. Após os tratamentos com ácido acético e peróxido de hidrogénio, as células foram lavadas e suspensas em meio fresco para mimetizar o plaqueamento, sendo depois avaliada a integridade da membrana plasmática por marcação com iodeto de propídio. Os nossos resultados mostraram que, após o estímulo ser removido, as células que ainda mantinham a integridade da membrana plasmática continuam o processo de morte celular e perdem a integridade da membrana plasmática em meio fresco e a capacidade de se dividir. Ambos os estímulos induziram a translocação de Nhp6Ap-GFP, caraterística de necrose. Em conclusão, desenvolvemos com sucesso um método capaz de demonstrar o momento de perda da integridade celular por ácido acético e peróxido de hidrogénio em leveduras, contribuindo para uma melhor caracterização da morte celular em levedura e para estabelecer a ordem cronológica de diferentes eventos, ajudando a caracterizar o processo de necrose secundária após apoptose.

The balance between cell division and cell death is extremely important for the development and maintenance of multicellular organisms. Uncontrolled cellular proliferation can result in the development of cancer, whereas an excessive level of cell death can result in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Yeasts have served as a successful research tool for the last century, including in the cell death field. In addition to being the most extensively studied eukaryotic organism, it also contributed to the current knowledge of several cellular mechanisms conserved between the human species and yeast, like death execution machinery. Acetic acid and hydrogen peroxide are among the most common agents that have been reported to induce an apoptotic phenotype in yeast, associated with loss of viability but maintenance of plasma membrane integrity. This concept would at first seem implausible, but one should consider that plasma membrane integrity is assessed during the exposure of cells to a stimuli and cell viability assessed only days after plating those cells. Therefore, the number of cells with plasma membrane integrity and the CFU counts do not always correlate in an apoptotic scenario. Since cell death occurs only upon irreversible plasma membrane breakdown, novel methods to better correlate these hallmarks are needed. So, the main objective of this work was to develop a simple method able to explore at what point after an apoptotic stimuli and plating cells, do cells die as result of plasma membrane disruption. After acetic acid and hydrogen peroxide treatments, cells were washed and suspended in fresh medium to mimic plating and plasma membrane integrity was analysed by PI staining. Our results showed that after the stimuli is removed, cells that still maintained plasma membrane integrity continue the cell death process and lose plasma membrane integrity in fresh medium and the ability to divide. The point-of-no-return for cells after exposure to hydrogen peroxide occurs much later than in acetic acid treatments, most likely due to a slower transition from apoptosis to secondary necrosis. Both stimuli induced Nhp6Ap-GFP translocation, a hallmark of necrosis. In conclusion, we successfully developed a method capable of demonstrating the moment of cell integrity loss by acetic acid and hydrogen peroxide in yeast. These results contributed to a better characterization of yeast cell death induced by these stimuli and set some chronological times points for different events helping to better define the process of secondary necrosis after apoptosis.