Development of new supramolecular hypergelators based on non-natural amino acid residues

Abstract

Employing amino acids and peptides as molecular building blocks provides unique opportunities for generating supramolecular hydrogels, owing to their inherent biological origin, bioactivity, biocompatibility, and biodegradability. However, they can suffer from proteolytic degradation. Ultrashort peptides (< 8 amino acids) attached to an aromatic capping group are particularly attractive alternatives as minimalistic low molecular weight hydrogelators. Peptides with low critical gelation concentration (CGC) are especially desirable, due to the low weight percentage required to obtain a hydrogel, making them more cost-effective. In this work, seven non-natural peptides were prepared. These peptides were based on different subclasses: dehydrodipeptides, dehydrotripetides and non-canonical (in structure and stereochemical configuration) dipeptides. Their self-assembly properties were studied, and the results showed that all compounds, with the exception of 3-indolepropionyl-D-4-benzoylphenylalanyl-D homophenylalanine, can form self-standing hydrogels with ultralow critical gelation concentrations using a pH trigger. Scanning transmission electron microscopy images showed a network of entangled fibres for all six hydrogels, while vesicular/aggregated structures were observed for the dipeptide which failed to produce a hydrogel. Circular dichroism spectroscopy was performed to evaluate the aggregation of peptides into characteristic secondary structures. Generally, the results suggest β-sheet or random coil like structures. According to the rheology results, the hydrogelators are viscoelastic materials with an elastic modulus G` that falls in the range of native tissue (0.37 kPa brain – 4.5 cartilage). The cytotoxicity of the new compounds was also tested using human keratinocytes (HaCaT cell line). In general, the results suggest that all seven compounds are not cytotoxic, although some peptides have shown a small impact in cell viability. In sustained release assays, the effect of the charge of the model drug compounds on the rate of cargo release from the hydrogel network was evaluated. The hydrogels showed a sustained release of methyl orange (anionic) and ciprofloxacin (neutral), while methylene blue (cationic) was retained by the hydrogel network. The non-natural peptides developed within this work constitute promising biomaterials to be further explored and used as new therapeutic platforms for localized drug delivery systems.

Neste trabalho, foram sintetizados sete di e tripéptidos contendo aminoácidos não-naturais o que os torna resistentes à proteólise. Assim, foram preparados três dipéptidos e dois tripéptidos contendo o desidroaminoácido desidrofenilalanina e dois dipéptidos com resíduos de D-homofenilalanina e D-4- benzoilfenilalanina. As propriedades de auto-associação destes péptidos foi estudada e os resultados mostraram que todos os péptidos, com a exceção do dipéptido de D-4-benzoilfenilalanil-D homofenilalanina N-protegido com o ácido 3-indolpropenoico, formam hidrogéis com concentrações críticas de gelificação baixas. Estes hidrogéis foram obtidos utilizando o método de alteração do pH utilizando a glucono-δ-lactona. As imagens de microscopia eletrónica de transmissão de varrimento revelaram uma rede de fibras entrelaçadas nos seis hidrogéis, enquanto que o composto que não formou um hidrogel mostrou estruturas vesiculares. Os espetros de dicroísmo circular foram efetuados para avaliar as estruturas secundárias resultantes da agregação dos péptidos. Os resultados evidenciaram estruturas em folha β e random coil. Estudos reológicos mostraram que os hidrogéis são materiais viscoelásticos com valores para o módulo de elasticidade G` situados entre os encontrados para os vários tecidos biológicos (0.37 kPa cérebro – 4.5 kPa cartilagem). A citotoxicidade dos péptidos foi testada em queratinócitos humanos (HaCaT). Os resultados obtidos sugerem que os péptidos em estudo não são citotoxicos, apesar de terem um pequeno impacto na viabilidade celular. Nos ensaios de libertação controlada, foi estudado o efeito da carga de compostos modelo na taxa de libertação a partir dos hidrogéis. Verificou-se a libertação do alaranjado de metilo (aniónico) e da ciprofloxacina (neutra) a partir dos hidrogéis e a retenção do azul de metileno (catiónico). Os novos hidrogéis baseados em péptidos não-naturais desenvolvidos neste trabalho constituem uma classe de biomateriais bastante promissora cujo estudo irá prosseguir com o objetivo de criar novas plataformas terapêuticas para a entrega localizada e controlada de fármacos.