Regulation of plasma membrane nutrient transporters in yeast

Abstract

Plasma membrane (PM) transporters play pivotal roles in the import of nutrients, including sugars, amino acids, nucleobases, carboxylic acids, and metal ions that surround living cells, including yeasts. The selective removal of these transporters by endocytosis is one of the most important regulatory mechanisms that ensures a rapid adaptation of yeast cells to the changing environment (e.g., nutrient fluctuations or different stresses). Jen1 is a lactate-pyruvate-acetate-propionate proton-symporter (1:1 stoichiometry) localized at the PM of the yeast Saccharomyces cerevisiae growing under non-fermentable carbon sources (lactic acid, pyruvic acid, ethanol, glycerol). The addition of glucose to lactate-grown cells or the prolonged growth (≈ 24 h) in lactic acid (alkali stress) triggers Jen1 internalization and degradation via the MVB degradative pathway. These processes involve the activation of distinct intracellular signalling pathways and the recruitment of different adaptors proteins (called α-arrestins). Despite the advances that have been made in the past years, there are still some unanswered questions regarding these mechanisms. The aim of the present study was to exploit the mechanisms behind Jen1 endocytosis induced by glucose and alkali stress. In particular, we aimed to address the hypothesis that the cytosolic termini of Jen1 is involved in the regulation of transporter internalization. The construction of specific Jen1 N- and/or C- truncated versions enabled a better understanding about the role of Jen1 cytosolic termini in its response to signal-elicited endocytosis, but also unveiled an unexpected role of the termini in transporter biogenesis, PM stability, and substrate affinity. Additional experimental assays demonstrated that the two termini of Jen1 interact dynamically to exert their distinctive effects on stability and response to endocytosis. Jen1-GFP localization and turnover were also studied using carbon-limited (lactate and ethanol) continuous cultures of S. cerevisiae, where several parameters were kept at preferred setpoints, including the extracellular pH that, when it reaches neutral to alkali values, leads to Jen1 endocytosis. A full transcriptomics (results not yet available) and metabolomics characterization of Jen1 endocytosis triggered by alkali stress was then performed. Results showed that removal of Jen1 from PM is likely a mechanism that prevents loss of intracellular carbon through this transporter when cells are cultivated at alkalinization conditions, when the electrochemical proton gradient (intracellular pH < extracellular pH) favours the efflux from the thermodynamic perspective. The further construction and use of yeast mutants enabled to propose a role of RIM101 and SNF1 signalling pathways in regulating pH-induced Jen1 turnover in yeast, in coordination with TORC1.

As proteínas transportadoras localizadas na membrana plasmática (MP) desempenham um papel fundamental na importação de nutrientes, incluindo açúcares, aminoácidos, ácidos nucléicos, ácidos carboxílicos e iões metálicos presentes no ambiente das células vivas, incluido leveduras. A remoção seletiva destes transportadores por endocitose representa um dos mecanismos de regulação mais importante, assegurando uma rápida adaptação das células de levedura a um ambiente em constante mudança (p.ex. flutuações no nutrientes ou diferentes stresses). O Jen1 é um simportador de lactato piruvato-acetato-propionato com protões (estequiometria 1:1) localizado na MP da levedura Saccharomyces cerevisiae cultivada em meios com fontes de carbono não fermentescíveis (ácido lático, ácido pirúvico, etanol e glicerol). A adição de glucose, a células previamente cultivadas em meio com lactato como única fonte de carbono e energia, ou o crescimento prolongado (≈ 24 h) em ácido lático (stresse alcalino), desencadeiam a internalização e dedradação do Jen1 pela via de degradação MVB. Estes processos envolvem a ativação de vias de sinalização intracelular distintas e o recrutamento de inúmeras proteínas adaptadores (também designadas α-arrestinas). Apesar dos avanços ocorridos nos últimos anos, permanecem ainda por esclarecer muitos mecanismos envolvidos na endocitose do Jen1. O presente estudo teve como objetivo explorar os mecanismos endocíticos do Jen1 induzidos pela glucose e pelo stresse alcalino. Em particular, pretendeu-se estudar o envolvimento dos terminais citosólicos do Jen1 na regulação da sua internalização. A construção de versões do Jen1 truncadas no N- e/ou C- terminais, permitiram uma melhor compreensão sobre o papel dos terminais citosólicos na resposta do Jen1 ao processo endocítico, mas também revelou uma função inesperada dos terminais na biogénese do transportador, estabilidade na MP e afinidade aos substratos. Ensaios experimentais adicionais demonstraram que os terminais do Jen1 interagem de forma dinâmica. Para além disso, a localização e turnover do Jen1-GFP em S. cerevisiae foram estudados usando culturas em crescimento contínuo limitadas pela disponibilidade da fonte de carbono (lactato e etanol). Os resultados mostraram que a pH alcalino ocorre endocitose do Jen1. Estes estudos visaram a caracterização transcriptómica (resultados ainda não disponíveis) e metabólica global da endocitose do Jen1 induzida pelo stresse alcalino. Os resultados sugeriram que a remoção do Jen1 da MP constitui um mecanismo de interrupção da perda de carbono mediada pelo Jen1 a pH alcalino, quando o gradiente eletroquímico de protões (pH intracelular < pH extracelular) favorece o efluxo do ponto de vista termodinâmico. Estudos em mutantes de levedura permitiram estabelecer um papel das vias de sinalização RIM101 e SNF1 na regulação e turnover do Jen1 em reposta ao pH, em coordenação com a via TORC1.