Novel enzyme-based bioprocess to produce the prebiotic epilactose

Abstract

A epilactose é um oligossacárido funcional raro e ainda muito pouco explorado. Esta tese teve como objetivo desenvolver um novo bioprocesso enzimático para a produção de epilactose, bem como a sua purificação e avaliação do seu potencial efeito prebiótico. A levedura Saccharomyces cerevisiae foi usada como hospedeiro para a produção heteróloga da enzima celobiose 2-epimerase da bactéria Caldicellulosiruptor saccharolyticus (CsCE). A estirpe mais promissora produziu uma CsCE com atividade específica de 1.22 U/mg, resultando num rendimento de epilactose de 4.99 g/g (epilactose/proteína). Sob as condições ótimas determinadas (80 ºC, pH 7.5), a produção de epilactose a partir de lactose alcançou uma produtividade de 9 g/L·h e um rendimento máximo de 27%, o valor mais elevado alguma vez reportado usando a enzima CsCE produzida por um hospedeiro reconhecido como seguro. A enzima produzida por S. cerevisiae provou ser adequada para a produção de misturas de prebióticos enriquecidas em epilactose. No entanto, há ainda uma quantidade considerável de lactose que não reagiu e que necessita ser removida para se obter um produto final mais puro. Após selecionar a melhor enzima para hidrolisar lactose e otimizar as condições da reação através de desenho experimental, 99.5% da lactose foi hidrolisada utilizando β-galactosidase de Aspergillus niger. Posteriormente, duas estratégias diferentes (tratamento com carvão ativado ou com microrganismos) foram comparadas no que respeita a remoção de monossacáridos. O método mais eficaz foi a utilização da levedura S. cerevisiae, resultando numa redução de 96.4% do teor de monossacáridos. O processo global culminou numa mistura contendo 87% de epilactose e um rendimento de recuperação de 76.4%. A epilactose mais pura foi sujeita a fermentações in vitro usando inóculos fecais para se avaliar o seu potencial prebiótico. Foram utilizados dois dadores fecais diferentes, um seguindo uma dieta Mediterrânica (DM) e outro adotando uma dieta vegana (DV). A produção de metabolitos e a modulação da microbiota intestinal confirmou o elevado potencial prebiótico da epilactose e revelou que a sua ação pode ser independente dos hábitos alimentares. O principal resultado foi a estimulação considerável de bactérias produtoras de butirato e a consequente produção deste metabolito, que foi significativamente superior em comparação com lactulose DM: 70 vezes, DV: 29 vezes) e rafinose (DM: 63 vezes, DV: 89 vezes). Para finalizar, a epilactose foi incorporada num iogurte de soja funcional, que revelou propriedades muito interessantes e importantes para a aceitabilidade do consumidor. Os resultados reunidos nesta tese representam importantes desenvolvimentos no estudo da epilactose enquanto potencial composto prebiótico.

Epilactose is a rare functional oligosaccharide and is still a very under explored compound. This thesis aimed to develop a novel enzymatic bioprocess for the production of epilactose, as well as its purification and the evaluation of its potential prebiotic activity. The yeast Saccharomyces cerevisiae was used as host for the heterologous production of cellobiose 2-epimerase from Caldicellulosiruptor saccharolyticus (CsCE). The most promising strain produced a CsCE with a specific activity of 1.22 U/mg, resulting in an epilactose yield of 4.99 g/g (epilactose/protein). Under the determined optimal conditions (80 ºC, pH 7.5), the production of epilactose from lactose (50 g/L) achieved a productivity of 9 g/L·h and a maximum yield of 27%, the highest value ever reported using CsCE enzyme produced by a GRAS host. The enzyme produced by S. cerevisiae was proven to be suitable for the production of epilactose-enriched prebiotic mixtures. Nonetheless, a considerable amount of unreacted lactose still needs to be removed in order to obtain a purer epilactose. After a screening study to find the best enzyme for lactose hydrolysis and the optimization of the reaction conditions through experimental design, 99.5% of the lactose was hydrolyzed using the enzyme β-galactosidase from Aspergillus niger. Afterwards, two different strategies (activated charcoal and microbial treatment) were compared in terms of monosaccharides removal. The most effective method was the use of the yeast S. cerevisiae, resulting in a 96.4% reduction of the monosaccharides content. The overall process culminated in a mixture with 87% of epilactose and a recovery yield of 76.4%. The purer epilactose was submitted to in vitro fecal fermentations in order to evaluate its potential prebiotic effects. Two different fecal donors were used, one following a Mediterranean diet (DM) and another one adopting a Vegan diet (DV). The metabolite production and the gut microbiota modulation confirmed the high prebiotic potential of epilactose and revealed that it can be independent of the dietary habits. The main result was the considerable stimulation of butyrate-producing bacteria and the consequent production of this metabolite, that was significantly higher compared to lactulose (DM: 70-fold, DV: 29-fold) and raffinose (63-fold, DV: 89-fold). Finally, epilactose was incorporated in a functional soy yogurt, that revealed very interesting and important properties for consumer acceptability. The results gathered in this thesis represent important developments on epilactose research as a potential prebiotic compound.