Optimization of fructooligosaccharides production in Zymomonas mobilis

Abstract

Os frutooligosacarídeos (FOS) são prebióticos promissores no mercado crescente dos alimentos funcionais. Industrialmente, são produzidos a partir da sacarose por ação das enzimas frutosiltransferase (FTase) ou b-frutofuranosidase (FFase). No entanto, este processo apresenta baixas conversões e gera misturas com baixa pureza devido às elevadas quantidades de glucose libertadas durante a produção dos FOS. A Zymomonas mobilis é uma bactéria que possui enzimas nativas (levanosucrase) capazes de converter a sacarose em FOS. O principal objetivo deste trabalho foi eliminar a atividade da invertase na Z. mobilis e avaliar o uso de resíduos agro-industriais como substratos de baixo custo na produção de FOS. Inicialmente, o melaço e o licor de maceração de milho (CSL) foram avaliados como fontes alternativas de carbono e azoto. O meio composto por 200 g L-1 de sacarose em melaço, 12 g L-1 de CSL e 8 g L-1 de extrato de levedura (CSLM) foi considerado o mais promissor para produzir FOS. Em matraz, foram produzidos 58,15 ± 0,21 g L-1 de FOS (1,211 ± 0,004 g L-1 h-1 ; 0,307 ± 0,003 gFOS gsacarose-1 ) numa mistura que incluí a 1-questose, a 6-questose, a nistose e a neonistose. A realização de ensaios à escala de biorreator em modo descontínuo permitiu aumentar o rendimento do processo em 1,6 vezes (0,482 ± 0.008 gFOS gsacarose-1 ). A deleção do gene da invertase do genoma de Z. mobilis ZM4 foi realizada por recombinação homóloga utilizando um plasmídeo suicida. Após introdução deste plasmídeo na Z. mobilis e a recombinação homóloga, obteve-se a estirpe Z. mobilis SacC-. Com esta estirpe modificada observou se uma redução de 70 % na produção de monossacarídeos e um aumento de 9 vezes na produção de levano comparativamente à estirpe selvagem. A implementação do modo de operação semi-contínuo por pulsos utilizando o meio CSLM permitiu produzir 41,92 ± 2,52 g L-1 de FOS (0,29 ± 0,02 g L-1 h-1 ; 0,25 ± 0,07 gFOS gsacarose-1 ). Rendimentos e produtividades semelhantes foram obtidos à escala de biorreator. De modo a melhorar a produção de FOS, o gene que nativo da levanosucrase (sacB) foi sobre-expresso. A construção deste plasmídeo foi concluída com êxito, porém a sua transformação em Z. mobilis SacC não foi conseguida no decorrer desta dissertação. De acordo com o no nosso conhecimento, este trabalho descreve pela primeira vez a produção de FOS, com uma estirpe geneticamente modificada de Z. mobilis, num processo de uma só etapa utilizando resíduos agro-industriais. Embora estes resultados sejam promissores, será necessária uma otimização adicional para que se possa estabelecer um processo competitivo.

Fructooligosaccharides (FOS) are promising prebiotics in the growing market of functional foods. Industrially, these compounds are produced from sucrose by the action of fructosyltransferase (FTase) or b-fructofuranosidase (FFase) enzymes. However, this process has low conversion yields and generates mixtures with low purity due to the high amounts of glucose released during its production. Zymomonas mobilis is a well-known ethanol producing bacterium with native enzymes (levansucrase) able to convert sucrose into FOS. The main goal of this work was to use synthetic biology approaches to eliminate invertase activity in Z. mobilis and further study the potential use of agro-industrial by-products as low cost substrates in FOS production. Firstly, molasses and corn steep liquor (CSL) were evaluated as alternative carbon and nitrogen sources. Medium containing 200 g L-1 of sucrose in molasses, 12 g L-1 of CSL and 8 g L-1 of YE (CSLM) was found to be the most promising medium for FOS production. In shake flask, 58.15 ± 0.21 g L-1 of FOS were synthesised (1.211 ± 0.004 g L-1 h-1 , 0.307 ± 0.003 gFOS gsucrose-1 ), resulting in a diverse FOS profile that included 1-kestose, 6-kestose, nystose and neonystose. When the batch process was studied at bioreactor scale, a 1.6-fold increase in FOS yield was observed (0.482 ± 0.008 gFOS gsucrose-1 ). Invertase deletion from the Z. mobilis ZM4 genome was accomplished by homologous recombination of an engineered suicide plasmid. After introducing this plasmid into Z. mobilis and homologous recombination, a sacC disrupted strain was obtained (Z. mobilis SacC-). Using this strain, a 70 % reduction in monosaccharide production and a 9.0-fold increase in levan formation was observed when compared to the wild-type strain. Implementation of a fed-batch approach with CSLM medium allowed to produce 41.92 ± 2.52 g L-1 of FOS (0.29 ± 0.02 g L-1 h-1 , 0.25 ± 0.07 gFOS gsucrose-1 ). When the process was studied at bioreactor scale, similar yields and productivities were obtained. To further improve FOS production using Z. mobilis strains, we aimed to overexpress its native levansucrase gene (sacB). Plasmid construction was successfully completed, however transformation into Z. mobilis SacC was unsuccessful during this dissertation. To our knowledge, this work describes for the first time the production of FOS using a genetically modified Z. mobilis strain in a one-step approach with agro-waste residues. While these results are promising, still additional optimization is needed to establish a competitive process.