Engineering of a fluorescent bacteriophage for amyloid-β oligomers detection

Abstract

Alzheimer's disease was first described in 1907 by Dr. Alöis Alzheimer in Frankfurt. Since then, Alzheimer's has become the leading cause of dementia worldwide. This disease is currently characterized by a set of cognitive, behavioural, physiological, physical, and other symptoms, such as short-term memory loss, impulsivity, depression, visuospatial problems and sleep disorders, among others. Two biomarkers have been identified for Alzheimer's disease, namely amyloid-β and Tau proteins. Both appear to be related with the disease development, but their role is not yet fully understood. Various explanations for the function of each protein during the development of the disease have already been put forward, but no theory has yet been definitively proven. Nevertheless, it is known that the accumulation of amyloid-β in the brain can begin up to 20 years before the onset of cognitive decline. The diagnosis of Alzheimer's remains fundamentally a clinical diagnosis, in which the patient must present with symptoms of the disease for it to be diagnosed, where irreversible brain damage has already occurred. It is therefore imperative to create a method capable of diagnosing Alzheimer's disease in advance, based on the biomarkers of the disease. To this end, this study focused on the development of chemically modified bacteriophages (phages), using the previously genetically engineered phages with a fluorochrome attached to the surface of the phage for the early detection of amyloid-β oligomers. In this way, it was possible to optimize the phage labelling protocol, testing various parameters of the process, such as the method of purifying the labelled phages, fluorochrome concentration, agitation during the reaction and reaction time. The permeability of the fluorescent phages through the blood-brain barrier was also tested, proving that the permeability decreases when compared to the non-fluorescent phages, however, tests on animal models are necessary to better prove this result, additionally, it was demonstrated that the integrity of the barrier was not compromised by the presence of the phages.

A doença de Alzheimer foi, primeiramente, descrita em 1907 pelo Doutor Alöis Alzheimer em Frankfurt. Desde então, a doença de Alzheimer tornou-se na principal causa de demência a nível mundial. A doença, atualmente, é caracterizada por um conjunto de sintomas cognitivos, comportamentais, psicológicos, físicos e outros, como por exemplo, perda de memória a curto prazo, impulsividade, depressão, problemas viso-espaciais e distúrbios de sono, entre outros. Dois biomarcadores foram identificados para a doença de Alzheimer, nomeadamente amiloide β e proteína Tau. Ambos aparentam ter uma relação com desenvolvimento da doença, contudo o seu papel ainda não é inteiramente compreendido. Várias explicações para a função de cada proteína durante o desenvolvimento da doença já foram propostas, no entanto, ainda nenhuma teoria foi definitivamente provada. Não obstante, é conhecido que a acumulação de amiloide-β no cérebro pode começar até 20 anos antes do início do declínio cognitivo. O diagnóstico da doença de Alzheimer continua a ser um diagnóstico fundamentalmente clínico, em que o paciente tem de se apresentar com sintomas da doença para esta ser diagnosticada, existindo já dano cerebral irreversível. Desta forma a criação de um método que seja capaz de diagnosticar esta doença de forma antecipada com base nos biomarcadores da doença é imperativo. Com este objetivo, o presente trabalho focou-se no desenvolvimento de bacteriófagos (fagos) quimicamente marcados com um fluorocromo ligado às proteínas da superfície para a deteção de amiloide-β a partir de bacteriófagos previamente geneticamente modificados. Desta forma foi possível otimizar o protocolo de marcação dos fagos, sendo testados diversos parâmetros do processo, como método de purificação dos fagos marcados, concentração de fluorocromo, agitação durante a reação e tempo de reação. Por fim, a permeabilidade da barreira hematoencefálica aos fagos fluorescentes foi testada, comprovando-se que a permeabilidade diminui comparando com os fagos não fluorescentes, contudo, testes em modelos animais são necessários para melhor comprovar este resultado, adicionalmente, foi demonstrado que a integridade da barreira não foi comprometida pela presença dos fagos.