Developing and validation of a novel antimicrobial coating strategy for endotracheal tubes to prevent ventilator-associated pneumonia

Abstract

A pneumonia associada à ventilação mecânica (VAP), infeção nosocomial com elevada mortalidade, é causada principalmente pelo desenvolvimento de biofilmes nos tubos endotraqueais (ETT). Os atuais métodos de diagnóstico de VAP são imprecisos devido à existência de várias doenças que se assemelham a esta infeção. Este trabalho teve como principais objetivos: desenvolver um método de Hibridação In Situ por Fluorescência de Ácidos Nucleicos Peptídicos (PNA-FISH) para o diagnóstico de VAP; avaliar a formação de biofilmes por espécies relacionadas com VAP em superfícies de materiais distintas (poliestireno vs. PVC); e estudar um novo revestimento de PVC para prevenir a adesão de biofilmes. No estudo do PNA-FISH, foi examinado o efeito da temperatura (52ºC, 58ºC, 60ºC e 62ºC) e da concentração de formamida (30% vs. e 5% v/v) na especificidade de cinco sondas PNA concebidas para a deteção de Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus epidermidis e Acinetobacter baumannii. A sonda de P. aeruginosa apresentou hibridação de forma consistente, independentemente das condições testadas; o sinal da sonda de K. pneumoniae variou com a estirpe alvo, apresentando um sinal mais elevado a 52ºC e 60ºC. Por sua vez, as restantes sondas apresentaram sinal fraco ou nulo no microscópio de fluorescência. Relativamente ao efeito da formamida, em geral, verificou-se uma melhor hibridação quando se utilizou HS2 (solução de hibridação com 5% (v/v) de formamida). Porém, este parâmetro também foi influenciado pela sonda utilizada, havendo casos em que ocorreu hibridação mesmo utilizando-se HS1 (solução de hibridação com 30% (v/v) de formamida). Para impedir a formação de biofilmes compostos por P. aeruginosa, S. aureus e Candida albicans SC 5314 em ETTs, foi explorada uma estratégia inovadora para o revestimento de PVC. Esta abordagem implica a imobilização da ciprofloxacina (CIP) e da clorexidina (CHX) através da funcionalização da polidopamina (pDA) na superfície do PVC. P. aeruginosa e S. aureus apresentaram a maior capacidade de formar biofilmes em poliestireno (8,0 log10 CFU/mL), seguidos por C. albicans (6,7 log10 CFU/mL). Quando cultivadas em biofilmes de duas espécies com P. aeruginosa, S. aureus diminuiu 1,3 log10 CFU/mL o seu número de células, enquanto C. albicans permaneceu inalterada. Nos biofilmes de três espécies, P. aeruginosa, S. aureus e C. albicans podiam coexistir, apresentando 6,8 log10 UFC/mL, 7,1 log10 UFC/mL e 6,5 log10 UFC/mL, respetivamente. No entanto, verificou-se uma diminuição do número de células em cada um dos microrganismos quando comparado com os seus biofilmes uma espécie. As três espécies apresentaram padrões distintos na formação de biofilme nas superfícies de PVC, com predominância de C. albicans (7,2 log10 CFU/mL), seguida de S. aureus (6,2 log10 CFU/mL) e P. aeruginosa (5,5 log10 CFU/mL). Curiosamente, a superfície de PVC modificada com CIP/CHX resultou numa diminuição drástica do número de células bacterianas/fúngicas cultiváveis. O FISH utilizado nestes consórcios mostrou, no entanto, a presença e a discriminação de todas as espécies nos biofilmes em superfícies não revestidas e a população bacteriana no biofilme formado em PVC revestido. Assim, a imobilização do PVC com CIP e CHX permitiu que P. aeruginosa, S. aureus e C. albicans passassem para um estado de células não cultiváveis.

Ventilator-associated pneumonia (VAP), a nosocomial infection with high mortality, is primarily caused by biofilm development on endotracheal tubes (ETT). Current diagnostic methods for VAP are imprecise due to the presence of similar diseases. This work had as its main goals: to develop a Peptide Nucleic Acid Fluorescence In Situ Hybridization (PNA-FISH) method for VAP diagnosis; to evaluate the biofilm formation by VAP-related species on distinct material surfaces (polystyrene vs. PVC); and to address a novel PVC coating for preventing biofilm adhesion. In the PNA-FISH study, the effect of temperature (52ºC, 58ºC, 60ºC, and 62ºC) and formamide concentration (30% vs. and 5% v/v) was examined on the specificity of five PNA probes designed for detection of Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, and Acinetobacter baumannii. The P. aeruginosa probe consistently showed hybridization, regardless of the conditions tested; the K. pneumoniae probe signal varied with the target strain, showing a higher signal at 52ºC and 60ºC. In turn, the remaining probes showed weak or no signal under a fluorescence microscope. Regarding the effect of formamide, in general, better hybridization was seen when HS2 (hybridization solution with 5% (v/v) formamide) was used. However, this parameter was also influenced by the probe used, and there were cases where hybridization occurred even when HS1 (hybridization solution with 30% (v/v) formamide) was used. To hinder the formation of biofilms comprising P. aeruginosa, S. aureus, and Candida albicans SC 5314 on ETTs, an innovative strategy for PVC coating was explored. This approach entails the immobilisation of ciprofloxacin (CIP) and chlorhexidine (CHX) via polydopamine (pDA) functionalization on the PVC surface. P. aeruginosa and S. aureus showed the highest ability to form biofilms on polystyrene (8.0 log10 CFU/mL), followed by C. albicans (6.7 log10 CFU/mL). When grown in dual-species biofilms with P. aeruginosa, S. aureus decreased by 1.3 log10 CFU/mL in its number of cells, whereas C. albicans remained unchanged. In triple-species biofilms, P. aeruginosa, S. aureus, and C. albicans could co-exist together, presenting 6.8 log10 CFU/mL, 7.1 log10 CFU/mL, and 6.5 log10 CFU/mL, respectively. However, there was a decrease in the number of cells in each of the microorganisms when compared to their single-species biofilms. All three species showed distinct patterns of biofilm formation on PVC surfaces, with C. albicans prevailing (7.2 log10 CFU/mL), followed by S. aureus (6.2 log10 CFU/mL) and P. aeruginosa (5.5 log10 CFU/mL). Intriguingly, the CIP/CHX-modified PVC surface resulted in a drastic decrease in the number of cultivable bacterial/fungal cells. FISH employed in these consortia showed, however, the presence and discrimination of all species within biofilms on uncoated surfaces and the bacterial population in biofilm formed on coated PVC. Thus, immobilising PVC with CIP and CHX allowed P. aeruginosa, S. aureus, and C. albicans to switch into a state of non-culturable cells.