Development of an improved method for the detection of Rhodococcus erythropolis based on specific viral proteins

Abstract

Rhodococcus erythropolis (R. erythropolis) is a Gram-positive bacterium that can be found widely in nature, especially in polluted areas. It is well-known for its ability to degrade both organic and inorganic pollutants. This makes it an important member of the biological consortium in biological wastewater treatment systems, including activated sludge (AS) systems. However, due to its hydrophobic nature, its overabundance can contribute to AS foaming, which is one of the most significant solid-liquid separation issues in AS systems. AS foaming incidents often lead to foam being discharged with treated effluent, which lowers effluent quality, poses safety risks, and raises concerns about surface water quality and water scarcity. Identifying R. erythropolis is crucial for developing strategies to manage its excessive growth. Current identification methods have limitations, including low sensitivity, modest specificity, and being resource-intensive and time-consuming. A promising solution to this challenge is the utilization of bacteriophage-encoded proteins, particularly endolysins, as innovative bacterial detection systems. The cell binding domain (CBD) of endolysins imparts high affinity and specificity, guiding the endolysin catalytic domain (CD) to its peptidoglycan substrate. Exogenously added, recombinant endolysins can effectively control bacterial growth, and when fused with a reporter as the Green Fluorescent Protein (GFP), they become a reliable detection method. In this study, two endolysin-encoding genes, g114 and g74, from two different phages, were identified and expressed as recombinant proteins (Gp114 and Gp74) in E. coli. However, they were insoluble, showing no lytic activity. To assess the binding efficiency of the CBD and the contribution of the CD, truncations (g114@568, g74@388, and g74@1048) and full-length g114 were expressed in E. coli fused with GFP. All four GFP-fusion proteins exhibited binding to R. erythropolis cells. Enhanced binding was achieved by pre-treating the cells with 1% Triton X-100 for 1 hour at 28°C and 250 rpm before binding. This optimized condition highlighted GFP-gp74@388 as a promising candidate for a novel R. erythropolis detection method in AS foam samples. Nevertheless, additional optimization is imperative to enhance the yield of soluble recombinant endolysins and their binding to bacterial cells, ensuring their suitability for large-scale applications

Rhodococcus erythropolis (R. erythropolis) é uma bactéria Gram-positiva amplamente distribuída na natureza, especialmente em áreas poluídas. É conhecida pela sua capacidade de degradar tanto poluentes orgânicos como inorgânicos, o que a torna um membro importante do consórcio biológico nos sistemas de tratamento biológico de águas residuais por lamas ativadas. No entanto, devido à sua natureza hidrofóbica, a sua proliferação excessiva pode contribuir para a formação de espuma, um dos problemas mais significativos na separação sólido-líquido nestes sistemas. Incidentes de espuma em lamas ativadas levam à libertação de espuma com o efluente tratado, o que reduz a qualidade do efluente, coloca em risco a saúde pública e suscita preocupações quanto à qualidade da água superficial e à escassez de água. A identificação do R. erythropolis é crucial para o desenvolvimento de estratégias que permitam controlar o seu crescimento excessivo. Os métodos de identificação atuais têm limitações, incluindo baixa sensibilidade, especificidade moderada e o consumo de recursos e tempo. Uma solução promissora para este desafio passa pela utilização de proteínas codificadas por bacteriófagos, particularmente endolisinas, como sistemas inovadores de deteção de bactérias. O domínio de ligação à parede celular (CBD) nas endolisinas confere alta afinidade e especificidade, direcionando o domínio catalítico da endolisina (CD) para o seu substrato, o peptidoglicano. A adição exógena de endolisinas recombinantes pode eficazmente controlar o crescimento bacteriano e, quando fundidas com a proteína verde fluorescente (Green Fluorescent Protein; GFP), tornam-se um método de deteção fiável. Neste estudo, duas endolisinas, g114 e g74, de dois fagos diferentes, foram expressas como proteínas recombinantes (Gp114 e Gp74) em E. coli. No entanto, estas proteínas eram insolúveis e não apresentavam atividade lítica. Para avaliar a eficiência de ligação do CBD e a contribuição do CD, foram expressos genes truncados (g114@568, g74@388 e g74@1048), assim como o gene completo g114, em E. coli com GFP. Todas as quatro proteínas de fusão com GFP mostraram capacidade de ligação às células de R. erythropolis. A ligação foi melhorada pelo pré-tratamento das células de R. erythropolis com Triton X-100 a 1% durante 1 hora a 28 °C e 250 rpm antes da reação de ligação. Esta condição otimizada destacou o GFP-gp74@388 como um candidato promissor para um novo método de deteção de R. erythropolis em amostras de espuma em sistemas de tratamento de águas residuais por lamas ativadas. No entanto, para serem utilizadas em aplicações em larga escala, são necessárias otimizações que aumentem o rendimento da expressão de endolisinas recombinantes de forma solúvel e que melhorem a ligação das proteínas às células bacterianas.