Optimization of peptides expression conditions for cosmetic formulations

Abstract

Nas últimas décadas, os péptidos e proteínas têm sido cada vez mais reconhecidos pelos seus efeitos benéficos em formulações cosméticas. A tecnologia de DNA recombinante tem desempenhado um papel fundamental na síntese destes compostos, frequentemente derivados de bactérias, leveduras ou células de mamíferos. A levedura Pichia pastoris destaca-se como um sistema de expressão popular, graças à sua rápida taxa de crescimento, facilidade de manipulação e eficiência em modificações pós tradução. A presença do promotor PAOX1 potencializa a expressão da proteína recombinante quando induzida com metanol. Apesar das vantagens mencionadas, desafios como o enrolamento incorreto de proteínas e a degradação por protéases podem afetar os rendimentos na produção de péptidos. Para superar estes obstáculos, diversas estratégias são utilizadas, incluindo a otimização de estirpes, modulação das condições de crescimento e expressão, bem como processos de purificação. Neste estudo, utilizou-se a estirpe P. pastoris GS115, que incorporava a sequência da albumina sérica humana (HSA) fundida com a repetição de um (1P), quatro (4P) e sete (7P) péptidos, na região C-terminal. A taxa de crescimento destas quatro estirpes foi inicialmente avaliada em quatro meios de cultura diferentes (BMGY, MGY, BSM e FM22), em que o meio BMGY demonstrou uma maior taxa específica de crescimento e tempos de duplicação mais rápidos. Posteriormente, o meio BMMY foi utilizado para os ensaios de expressão proteica. As técnicas de SDS-PAGE e Western blot revelaram, que nos primeiros ensaios com uma concentração de 0,5% (v/v) de metanol, apenas a estirpe GS115-HSA-4P apresentou expressão da proteína ao longo de 72 horas. Consequentemente, a concentração de metanol foi aumentada para 2,5% (v/v), o que fez com que a estirpe GS115-HSA-1P expressasse a proteína de interesse, após 48 horas, embora numa forma degradada. Além disso, diversas fontes de azoto foram testadas, incluindo ureia, glicina, acetato de amónio e sulfato de amónio, sendo que este último apresentou melhores resultados. Com base nestas descobertas, o sulfato de amónio foi utilizado como fonte de azoto para futuras experiências. Ao explorar diferentes valores de pH (6, 7 e 8), observou-se que o pH 8 foi o mais favorável para a expressão. Em conclusão, estes resultados contribuíram significativamente para o desenvolvimento de uma plataforma mais eficiente para a produção de péptidos, com potencial promissor para aplicações em formulações cosméticas.

Over the last decades, peptides and proteins have gained recognition for their beneficial effects in cosmetic formulations. Recombinant DNA technology has played a pivotal role in synthesizing these compounds, often derived from bacteria, yeast, or mammalian cells. Pichia pastoris, a yeast, stands out as a popular expression system due to its rapid growth rate, ease of manipulation, and proficiency in post-translational modifications. The presence of the PAOX1 promoter enhances recombinant protein expression when induced with methanol. Despite these advantages, challengessuch as protein misfolding and degradation by proteases can impact peptide production yields. To address these challenges, various strategies, including strain optimization, modulation of growth and expression conditions, and refining purification processes, can be employed. This study focuses on the P. pastoris GS115 strain, incorporating the human serum albumin (HSA) sequence fused with the repetition of one (1P), four (4P), and seven (7P) peptides in the C-terminal region. The growth rate of these four strains was initially evaluated in four different culture media (BMGY, MGY, BSM, and FM22), with BMGY demonstrating higher specific growth rate and faster doubling times. Subsequently, BMMY medium was used for protein expression assays. SDS-PAGE and Western blot techniques revealed that, in the first assays with 0.5% (v/v) methanol concentration, only the GS115-HSA 4P strain exhibited protein expression within 72 hours. Consequently, methanol concentration was increased to 2.5% (v/v), leading to GS115-HSA-1P expressing the protein of interest after 48 hours, albeit in a degraded form. Additionally, different nitrogen sources (urea, glycine, ammonium acetate, and ammonium sulfate) were tested, with ammonium sulfate yielding better results. Based on these findings, ammonium sulfate was utilized as a nitrogen source for subsequent experiments. Exploring different pH values (6, 7, and 8), revealed that pH 8 was more favourable to expression. In conclusion, these insights significantly contributed to the development of a more efficient platform for peptide production, holding promising potential for applications in cosmetic formulations.