Use of an engineered exosome-like delivery platform towards colorectal cancer therapy

Abstract

Colorectal cancer (CRC), stands as a critical global health concern, ranking among the deadliest cancers worldwide This is mostly due to late diagnosis, as symptoms only appear in late disease stages. Efforts have been dedicated to exploring innovative and selective therapies for cancer treatment. RNA interference (RNAi) has gained significant attention for its potential in sequence-specific messenger RNA (mRNA) silencing. Small interfering RNAs (siRNAs) are promising candidates for therapeutic gene silencing., however, unmodified siRNAs have limitations that affect clinical applications. In recent years, various delivery vehicles, including exosomes, have emerged as efficient siRNA delivery systems due to their biocompatibility and low immunogenicity. This study focused on the development of a novel treatment strategy, specifically the use of exosomes as nanocarriers for the delivery of a particular siRNA, designed to target the PI3KCA gene (siPI3KCA), a key player in the PAM pathway, in two distinct CRC cell lines – RKO and HCT15. Our investigation employed a multifaceted approach. Firstly, using lipofectamine, siPIK3CA was effectively delivered to the cells. We used western blot analysis combined with real-time PCR (RT-PCR) to analyze changes in protein and mRNA levels. Specifically, we study the expressions of PI3K, Akt and mTOR in detail. Moreover, the cytotoxic effect was determined by MTT. Results showed a reduction in PAM pathway genes, mRNA and protein expression, as well as a decrease in cellular viability. Secondly and expanding our scope, we explored exosomes - derived from HEK-293t cells. These EVs were meticulously characterized, confirming their optimal size, charge, and the presence of standard exosomal markers through techniques like nanoparticle tracking analysis, dynamic light scattering, and western blot assays. Treating CRC cells with siRNA-loaded exosomes resulted in a rapid and substantial reduction in PIK3CA, AKT, p-AKT, p-MTOR and MTOR gene and protein levels. Furthermore, cellular migration was evaluated through wound healing assay, revealing an efficient reduction in cellular motility. Altogether, these results surpassed the effectiveness of conventional lipofectamine methods in terms of speed and efficiency. In conclusion, this investigation underscores the potential of our siRNA approach, effectively suppressing PIK3CA in CRC cells, leading to significant reductions in cell viability, expression and migration. Resulting in a promising avenue, to revolutionize targeted CRC therapies.

O cancro colorrectal (CCR) é um problema grave de saúde a nível mundial, sendo um dos cancros mais mortais em todo o mundo. Esta situação deve-se sobretudo ao diagnóstico tardio, uma vez que os sintomas só aparecem em fases tardias da doença. Têm-se investido esforços na exploração de terapias inovadoras e seletivas para o tratamento do cancro. O RNA de interferência (RNAi) tem merecido grande atenção pelo seu potencial de silenciamento do RNA mensageiro (RNAm), apesar de apresentarem limitações que afetam as aplicações clínicas. Nos últimos anos, vários veículos de entrega, incluindo exossomas, têm surgido como sistemas eficientes de entrega de siRNA devido à sua biocompatibilidade e baixa imunogenicidade. Este estudo centrou-se no desenvolvimento de uma nova estratégia de tratamento, especificamente a utilização de exossomas como nanotransportadores para a entrega de um siRNA específico, concebido para atingir o gene PI3KCA (siPI3KCA), um ator chave na via PAM, em duas linhas celulares distintas de CRC - RKO e HCT15. A nossa investigação utilizou uma abordagem multifacetada. Em primeiro lugar, utilizando lipofectamina, o siPIK3CA foi eficazmente administrado às células.Utilizámos a análise western blot combinada com PCR em tempo real (RT-PCR) para analisar as alterações nos níveis de proteínas e de mRNA. Especificamente, estudámos as expressões de PI3K, Akt e mTOR em pormenor. Além disso, o efeito citotóxico foi determinado pelo MTT. Os resultados mostraram uma redução nos genes da via PAM, mRNA e expressão de proteínas, bem como uma diminuição na viabilidade celular. Posteriormente, explorámos os exossomas - derivados de células HEK-293t. Estes EVs foram caracterizados, confirmando o seu tamanho, carga e a presença de marcadores exossómicos através de técnicas como a análise de rastreio de nanopartículas, dispersão dinâmica de luz e ensaios de western blot. O tratamento de células CRC com exossomas carregados com siRNA resultou numa redução rápida e substancial dos níveis de genes e proteínas PIK3CA, AKT, p-AKT, p-MTOR e MTOR. Além disso, a migração celular foi avaliada através de um ensaio de cicatrização de feridas, revelando uma redução eficaz da motilidade celular. No seu conjunto, estes resultados ultrapassaram a eficácia dos métodos convencionais de lipofectamina em termos de rapidez e eficiência. Em conclusão, esta investigação sublinha o potencial da nossa abordagem de siRNA, suprimindo eficazmente o PIK3CA em células CRC, levando a reduções significativas na viabilidade, expressão e migração celular. O resultado é uma via promissora para revolucionar as terapias direcionadas para o CRC.