Physiological and molecular studies on the invader Hakea sericea: a contribution for its control

Abstract

Hakea sericea Schrad. (needlebush or silky hakea) is an Australian Proteaceae that can be found naturalized in South Africa, New Zealand and southern Europe. It presents xeromorphic adaptations in leaves, produces high amounts of long-lived, fire resistant seeds that are easily dispersed by both air and water, and relys on proteoid roots for enhanced nutrient uptake. Such unique abilities allowed H. sericea to proliferate and spread throughout its new habitats, being currently considered by regulatory agencies as one of the most agressive invaders established in Portuguese territory. Although mechanical and biological control have already been extensively tested in South Africa to constrain the expansion of H. sericea, in Portugal no large scale attempts have been made to control its spreading. Here we report the identification of a naturally occuring pathogenic fungus able to infect H. sericea that could, in a nearby future, be used as part of an integrated control strategy for this invader. The pathogenic agent was isolated from leaf spots of infected wild-growing H. sericea found in “Serra de Arga”, in north-western Portugal. Microscopical observation revealed typical Pestalotiopsis sp. 5-celled spores, whose members have been described as pathogenic for Proteaceae species. Thermocyclic amplification of the internal transcribed spacer region of the fungal rDNA, using ITS4 and ITS5 universal primers, identified the pathogenic agent as Pestalotiopsis funerea. Pathogenicity of P. funerea on H. sericea was confirmed with the infection of leaf-wounded and non-wounded 6-week-old in vitro-grown plants. Only the leafwounded plants sprayed with P. funerea developed lesions identical to those observed in wild-grown specimens. A major feature of H. sericea is the ability to produce proteoid roots in response to mineral scarcity, mainly N and P. Although the enhanced capacity of proteoid roots to absorb inorganic phosphate (Pi) has been mainly attributed to an increased root surface area and higher exudation of organic acids and phosphatases, here we focused on the Pi uptake system of proteoid roots by itself. Uptake experiments with 32Pi suggested the involvement of H+/Pi co- transport systems with Km values of 0.225 and 40.8 μM Pi, both prone to competitive inhibition with the analogs phosphite and arsenate, but not vanadate. This biphasic Pi uptake system with the highest affinity at submicromolar range is likely to confer H. sericea the ability to invade and proliferate throughout vast areas of nutrient-poor soils, where survival for most plant species seems harder. In plants, Pi uptake, translocation through tissues and interorganellar allocation is carried out by members of the phosphate transporter (PhT) family. Here we report the identification of four PhT genes (PiT2, PiT6, PH5 and PH7) from H. sericea genome. Through phylogenetic analysis and transmembrane domain (TMD) prediction, all identified genes were placed in the PhT1 family, meaning PiT2, PiT6, PH5 and PH7 are probably high- or low-affinity H+/Pi symporters involved in Pi transport into the cell. Phylogenetic analysis confirmed the homology between PhT1 members from different plant species, while PhT2 members (chloroplastidial H+/Pi symporters) were placed in a cluster of their own. Based on phylogeny, we also report the possible existence of new Na+/Pi symporter family in plants. The correlation between the expression site of each PhT1 with its deduced amino acid sequence has also been studied. Phylogenetic studies suggest that the amino acid structure of each PhT1 is insufficient to predict the tissue where the protein is likely to be expressed. Expression studies of PiT2, PiT6, PH5 and PH7 in plants grown in high- and low-Pi availabity shall provide insights on the Pi transport regulation mechanism of H. sericea.

Hakea sericea Schrad. (háquea-espinheiro ou háquea-picante) é uma Proteaceae nativa da Austrália que se encontra actualmente naturalizada na África do Sul, Nova Zelândia e partes do sul da Europa. Apresenta folhas com modificações xerofíticas e produz anualmente uma grande quantidade de folículos contendo sementes aladas. Estas sementes são libertadas apenas após a passagem de fogo ou morte da planta, sendo dispersas quer pelo ar, quer por cursos de água. Associada ao crescimento da H. sericea em solos pobres em minerais está a produção de raízes proteóides especializadas na captação de fosfato. Estas características únicas permitiram a fixação e proliferação de H. sericea em novos habitats, sendo actualmente considerada pelo Ministério do Ambiente como uma das invasoras mais agressivas em Portugal. Embora na África do Sul tivessem sido testadas formas de controlo mecânico e biológico desta espécie, em Portugal não se efectuou ainda qualquer tentativa em grande escala de controlar a invasão. Aqui reportamos a identificação de um fungo patogénico capaz de infectar H. sericea que poderá, num futuro próximo, ser usado como parte integrante de um programa de controlo desta espécie. O agente patogénico foi isolado a partir de lesões nas folhas de espécimes infectados a crescer nas encostas da Serra de Arga, no noroeste português. Por observação microscópica foram identificados esporos com cinco células típicos do género Pestalotiopsis sp. A amplificação termocíclica das regiões ITS do rDNA do fungo, usando os iniciadores oligonucleotídicos universais ITS4 e ITS5 permitiu a identificação do agente patogénico como sendo Pestalotiopsis funerea. A patogenicidade de P. funerea em H. sericea foi confirmada através da infecção de plântulas crescidas in vitro com ou sem pequenas incisões nas folhas. Apenas plantas lesadas e infectadas com P. funerea desenvolveram sintomas idênticos aos observados em plantas contaminadas presentes na Serra de Arga. Um dos principais atributos de H. sericea é a capacidade de produção de raízes proteóides em resposta à escassez de minerais, nomeadamente azoto e fósforo. Apesar da alta eficácia que estas raízes têm em captar fosfato ter sido associada sobretudo ao aumento da área de superfície da raiz e da grande capacidade de exsudação de ácidos orgânicos e fosfatases, neste trabalho focamo-nos no próprio mecanismo de aquisição de fosfato. Experiências de captação de 32Pi sugeriram o envolvimento de um sistema de co-transporte de fosfato com protões com valores de Km de 0.225 e 40.8 μM Pi, ambos susceptíveis a inibição competitiva pelos análogos fosfito e arsenato, mas não por vanadato. Este sistema bifásico de captação de Pi com um sistema com uma afinidade invulgarmente alta em plantas deve provavelmente permitir que H. sericea seja capaz de invadir e proliferar em áreas pobres em nutrientes, onde a sobrevivência de outras espécies aparenta ser dificultada. Nas plantas, a captação e translocação de fosfato através de tecidos e organelos está dependente de membros da família dos transportadores de fosfato (PhT). Neste trabalho reportamos a identificação de quatro genes PhT (PiT2, PiT6, PH5 e PH7) no genoma de H. sericea. Através de análise filogenética e predição de domínios transmembranares (TMD), todos os genes identificados foram caracterizados como membros da sub-família PhT1. Assim, PiT2, PiT6, PH5 e PH7 são provavelmente simportadores de Pi com protões de alta ou baixa afinidade envolvidos na captação de fosfato ao nível da membrana celular. A análise filogenética também confirmou a homologia entre todos os membros PhT1 analisados. Da mesma forma, todos os membros PhT2, simportadores cloroplastidiais de Pi com protões, formaram o seu próprio agrupamento filogenético. Reportamos também com base na filogenia, a possível existência de uma nova família de simportadores de fosfato com sódio em plantas. O estudo da relação entre o local de expressão de cada PhT1 com a sua estrutura aminoacídica deduzida sugere que esta é insuficiente para determinar o tecido onde a proteína deverá ser expressa. Assim, para que possamos conhecer mais profundamente os mecanismos de regulação do transporte de Pi em H. sericea será necessário realizar estudos de expressão de PiT2, PiT6, PH5 e PH7 em plantas crescidas em altas ou baixas concentrações de fosfato.