Increased thermotolerance in the absence of ataxin-3 in C. elegans

Abstract

Ataxin-3 is the protein involved in Machado-Joseph disease, one of the nine neurodegenerative disorders caused by a polyglutamine (polyQ) expansion. This polyQ expansion causes the appearance of misfolded protein species, aggregates, neuronal dysfunction and cell death. Ataxin-3 is a deubiquitylating (DUB) enzyme in vitro, is able to bind ubiquitin and ubiquitylated substrates and has been involved in the protein degradation by the ubiquitin-proteasome pathway (UPP). Accumulation of damaged or unneeded proteins due to the absence of a processing enzyme such as ATX-3 can disrupt cellular homeostasis. However, besides its putative role in the UPP, little is known about ataxin-3 cellular function. The possibility to carry out functional studies in a multicellular yet simple organism, and the availability of a C. elegans atx-3 knockout strain in our lab, led us to proceed our studies in this model. C. elegans lacking ATX-3 are viable and with no overt phenotype in basal conditions. However, considering the role of ataxin-3 in protein quality control we decided to analyze the effects of ataxin-3 absence in protein homeostasis stress conditions. In this work, we studied an ATX-3 knockout mutant after a heat stress insult that compromises the protein homeostasis of the whole organism. We showed that the mutant worms have an exacerbated stress response and survive significantly better than wild type animals upon a heat shock stimulus. The increased stress resistance is further enhanced by a previous mild heat shock. At a molecular level, ATX-3 mutants have a distinct profile with several molecular chaperones up-regulated at 25ºC (stress-threshold temperature), such as HSP-4 and HSP-16 family members – HSP-16.1 and HSP-16.49 – as analyzed by western blot and mRNA expression studies. These results suggested to us that the absence of ataxin-3 throughout C. elegans development might lead to a mild cellular stress, probably due to an imbalance of ATX-3 substrate degradation, having global consequences on protein homeostasis. To test this hypothesis, we used temperature-sensitive (ts) strains that constitute highly sensitive indicators of disruption in protein homeostasis, because ts mutant proteins are very dependent on the cellular folding environment. However, we have found no differences between wild type and mutant animals, in muscle and neuronal cells. Finally, we showed that the stress-resistance phenotype is dependent on the DAF-16 pathway, known to modulate aging. In summary, this work gathered significant insight into ataxin-3 biological function and pathways where it is involved.

A ataxina-3 é a proteína envolvida na doença de Machado-Joseph, uma das nove doenças neurodegenerativas causadas por uma expansão de poliglutaminas (poliQ). Esta expansão de poliQ está associada a uma alteração de conformação das proteínas, com consequente formação de agregados, disfunção neuronal e morte celular. A ataxina-3 humana é uma ubiquitina hidrolase in vitro e liga-se a ubiquitina e a substratos ubiquitilados, sugerindo um papel na degradação proteica através da via ubiquitina-proteassoma (UPP). A ausência de uma enzima processadora como a ataxina-3, pode perturbar a homeostasia celular. Contudo, além do seu potencial papel na via UPP, pouco se sabe acerca da função celular da ataxina-3. A possibilidade de desenvolver estudos funcionais num animal multicelular simples, e o facto de existir uma estirpe knockout para a ataxina-3 (ATX-3) no nosso laboratório, permitiu-nos prosseguir os estudos neste modelo. Estes animais são viáveis e não apresentam um fenótipo visível em condições fisiológicas normais. Contudo, considerando o papel da ataxina-3 no controlo de qualidade das proteínas, decidimos analisar os efeitos da ausência da ATX-3 numa situação de stress. Neste trabalho, estudámos um mutante ATX-3 após um choque térmico, que compromete a homeostasia celular proteica de todo o organismo. Mostrámos que os nemátodes mutantes têm uma resposta exacerbada ao stress e sobrevivem significantemente melhor do que os animais selvagens. Este aumento na termoresistência é ainda maior após um prévio choque térmico não letal. A nível molecular, os mutantes ATX-3 têm um perfil proteómico distinto, com algumas chaperonas moleculares sobre-expressas a 25ºC (a temperatura limite para induzir stress), tal como a HSP-4 e membros da família HSP-16 – HSP-16.1 e HSP-16.49 – como analisado por western-blot e estudos de expressão de mRNA. Estes resultados sugeriram-nos que a ausência da ATX-3, ao longo do desenvolvimento do C. elegans, pode levar a um stress celular, que resulta provavelmente de uma alteração na degradação de substratos da ATX-3, com consequências na homeostasia proteica celular global. Para testar esta hipótese, usámos estirpes termo-sensíveis (ts), que constituem indicadores muito sensíveis da perturbação da homeostasia proteica, uma vez que as proteínas ts mutantes dependem da homeostasia celular proteica. Contudo, não encontrámos diferenças entre a estirpe selvagem e os animais mutantes, em células musculares e neuronais. Por fim, mostrámos que o fenótipo termo-resistente é dependente da via do DAF-16, associada à modulação da longevidade. Em sumário, este trabalho originou pistas acerca da função biológica da ataxina-3 e das vias onde esta proteína está envolvida.