Natural origin polymer-based nanocarriers as tools for controlled release of bioactive factors aimed to manipulate stem cells performance in bone and cartilage tissue regeneration strategies

Abstract

The tremendous health and economic impact of skeletal disorders has led to the development of new strategies to promote the restoration of functional bone and cartilage tissues. Tissue Engineering and Regenerative Medicine strategies have risen as promising alternatives to stimulate the formation of functional tissues upon their injury or damage. Typical tissue engineering strategies involve the combination of scaffolding materials, cells and bioactive factors. Bone and cartilage are highly complex and hierarchical organized tissues and their regeneration and healing involves the combination of several bioactive agents, acting synergistically towards restoration of tissue structure and functionality. The development of drug delivery systems and their application in tissue engineering strategies has been subject of intensive research in recent years. However, approaches developed so far still present several limitations. Typically, the incorporation of release systems to stimulate tissue healing is done by the release of single or dual signaling molecules. These systems tend to fail in promoting the desired regeneration or they require supraphysiological levels of those bioactive factors, raising concerns regarding their side-effects and on the overall cost of therapy. Due to the complexity of native tissue healing and cellular interactions, it is expected that the formation of new functional tissue requires the interplay of several biomolecules presented in a spatiotemporal controlled manner. The major goal of this thesis was to originally develop nanoparticulate controlled delivery systems for release of bioactive factors known to promote the regeneration of bone and cartilage regeneration that can be subsequently incorporated into three-dimensional scaffolds in order to improve their performance and eventually overcome the limitations of current approaches above mentioned. These limitations were addressed in this thesis through two major approaches: (1) the release of a highly enriched concentrate of growth factors – Platelet Lysates – an autologous and easily obtained source of bioactive agents capable of providing high concentrations of several proteins known for their roles on osteogenic and chondrogenic differentiation of stem cells; (2) the promotion of a spatiotemporal controlled release of bioactive agents, through the development of nanoparticles, easily dispersed within three-dimensional scaffolding structures or targeted to cells and displaying the ability to be internalized and to promote the release of the drug inside the cells. Chitosan/chondroitin sulfate nanoparticles were developed through a polyelectrolyte complexation reaction between the two oppositely-charged polysaccharides and were designed to act as carriers for platelet lysates. These nanoparticulate carriers are particularly appealing for protein entrapment because they mimic the interactions observed in native extracellular matrix. These nanoparticles loaded with growth factors have shown the ability to act as replacement of bovine serum for twodimensional in vitro cultures of human adipose derived stem cells (hASCs), preserving the viability and proliferation profiles of those cells. The controlled release of platelet lysates also showed promising results regarding the promotion of osteogenic differentiation of hASCs. These findings were further confirmed in the subsequent studies, when these nanoparticles were successfully incorporated within poly (D,L-lactic acid) scaffolds. These sponges were produced by means of a supercritical fluid foaming methodology and the nanoparticles could be homogeneously distributed within the structure, without significantly altering the morphological, physico-chemical and mechanical properties of the scaffolds. When the particles loaded with platelet lysates were incorporated in the structure and hASCs were seeded on the constructs, earlier detection of bone-related markers was observed, suggesting enhanced osteogenic induction. The potential of these nanocarriers for cartilage regeneration was also demonstrated by the formation of a hydrogel based on the “bottom-up” assembling of platelet lysates-loaded nanoparticles, entrapping hASCs. The presence of platelet lysates stabilized and maintained the structural integrity of the hydrogel. Under chondrogenic induction, upregulation of chondrogenic markers was observed, thus showing the ability of platelet lysates to act both as a growth factor source and as a structural element in tissue engineering strategies. The last work of the thesis focused on the application of gelatin-based micelles for the intracellular delivery of dexamethasone. The use of a targeted system can be a promising way to enhance osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells because glucocorticoid-receptors are located intracellularly. Cells were isolated from rat bone marrow and incubated with dexamethasone-loaded gelatin micelles. After internalization occurred, these cells were seeded onto three-dimensional gelatin scaffolds and further implanted in vivo in a rat ulna critical size defect model. One month postimplantation results revealed massive new bone tissue formation in a dexamethasone-loaded micelles dosage-dependent manner, thus showing the efficacy of these nanocarriers in promoting the commitment of the seeded stem cells onto the osteoblast lineage.

O tremendo impacto económico e na qualidade de vida de pacientes afetados por doenças e traumatismos ao nível do osso e cartilagem tem levado ao desenvolvimento de novas estratégias para promover a recuperação funcional destes tecidos. As áreas de investigação de Engenharia de Tecidos e Medicina Regenerativa têm-se afirmado como uma alternativa promissora para estimular a formação de tecidos funcionais após uma lesão ou ferimento. Osso e cartilagem são tecidos com elevado grau de complexidade, organizados numa estrutura hierárquica e a sua regeneração envolve a combinação em sinergia de vários agentes bioativos para a restauração da estrutura e functionalidade do tecido. Estratégias típicas de engenharia de tecidos envolvem a combinação de materiais de suporte, células e fatores bioativos. O desenvolvimento de sistemas de libertação controlada de fármacos e a sua consequente aplicação em estratégias de engenharia de tecidos tem sido objeto de intensa pesquisa ao longo das últimas décadas. No entanto, esta abordagem ainda apresenta várias limitações. Normalmente, a incorporação de sistemas de libertação para estimular a regeneração de tecidos é feita pela libertação de um ou dois agentes bioativos. Estes sistemas tendem a falhar na promoção da desejada regeneração ou exigem níveis suprafisiológicos desses fatores bioativos, criando preocupações ao nível de efeitos colaterais e custo total da terapia. Devido à complexidade do processo de regeneração dos tecidos naturais e das interações celulares, espera-se que a formação de novo tecido funcional exija a interação de várias biomoléculas apresentadas com controlo espaço-temporal. O objectivo desta tese foi o desenvolvimento de nanopartículas como agentes de libertação controlada de fatores bioactivos conhecidos por promover a regeneração de osso e cartilagem. A abordagem seguinte foi a incorporação destes sistemas em suportes tridimensionais – “scaffolds”, de modo a melhorar o seu desempenho. As principais limitações encontradas nos estudos previamente publicados e que esta tese tentou superar são: (1) a libertação de um concentrado de fatores de crescimento – Lisados de Plaquetas – uma fonte autóloga e de fácil obtenção de agentes bioativos, capazes de disponibilizar elevadas concentrações de várias proteínas conhecidas pelos seus efeitos positivos nas diferenciações osteogénica e condrogénica de células estaminais; (2) promoção de um controlo espaço-temporal da libertação de agentes bioativos, através do desenvolvimento de nanopartículas, facilmente dispersas em estruturas tridimensionais ou orientadas para células específicas e exibindo a capacidade de serem internalizadas de modo a promover a libertação do fármaco no interior das células Nanopartículas de quitosano/sulfato de condroitina foram desenvolvidas através de uma reação de complexação de polieletrólitos entre dois polissacarídeos de cargas opostas e projetadas para atuar como veículos de libertação de lisados de plaquetas. Estas nanopartículas são particularmente apropriadas para o transporte de proteínas porque elas simulam as interações observadas na matriz extracelular nativa. Estas nanopartículas carregadas com fatores de crescimento demonstraram a capacidade de agir como substituto do soro bovino para culturas in vitro a duas dimensões de células estaminais humanas derivadas do tecido adiposo (“hASCs”), preservando os perfis de viabilidade e proliferação destas células. A libertação controlada de lisados de plaquetas também demonstrou resultados promissores em relação à promoção da diferenciação osteogénica das “hASCs”. Esta observação foi confirmada nos estudos seguintes, quando estas nanopartículas foram incorporadas em suportes à base de poli(ácido lático). Estas espumas foram produzidas pela técnica de fluidos supercríticos e as nanopartículas foram distribuídas de forma homogénea na estrutura, sem alterações significativas ao nível das propriedades morfológicas, físico-químicas e mecânicas dos suportes. Quando as partículas carregadas com lisados de plaquetas foram incorporadas na estrutura e as hASCs semeadas nesses suportes, foi observada uma deteção precoce de marcadores de formação óssea, sugerindo um aumento da indução osteogénica. O potencial destas nanopartículas para a regeneração de cartilagem foi igualmente demonstrado através da formação de um hidrogel baseado numa montagem “bottom-up” das nanopartículas carregadas com lisados de plaquetas, permitindo a encapsulação de “hASCs”. A presença dos lisados de plaquetas estabilizou a estrutura e manteve a integridade estrutural do hidrogel. A expressão de marcadores de cartilagem foi observada aquando da indução condrogénica, demonstrado a capacidade dos lisados de plaquetas em atuar simultaneamente como uma fonte de fatores de crescimento e como um elemento estrutural em estratégias de engenharia de tecidos. O último trabalho da tese foi focado na aplicação de micelas à base de gelatina para a libertação intracelular de dexametasona. A aplicação de um sistema dirigido é uma estratégia promissora para o incremento da diferenciação osteogénica de células estaminais mesenquimais uma vez que os recetores para os glucocorticóides encontram-se localizados no interior das células. As células foram isoladas a partir da medula óssea de ratos e incubadas com micelas de gelatina carregadas com dexametasona. Após a internalização das mesmas, estas células foram semeadas em suportes tridimensionais de gelatina e implantados in vivo em defeitos críticos do cúbito em ratos. Um mês após a implantação, os resultados reveleram uma formação massiva de novo tecido ósseo com um padrão dependente da dosagem de micelas carregadas com dexametasona, mostrando assim a eficácia destas nanopartículas em encaminhar as células estaminais não diferenciadas para a linhagem osteoblástica.