Péptidos com atividade antibiótica : síntese, caracterização e estudos de permeabilização de membranas modelo por espetroscopia de fluorescência

Abstract

A resistência aos antibióticos tradicionais tem levado à constante procura de potenciais fármacos substitutos. Uma das áreas em grande expansão é a dos péptidos com atividade antibiótica (AMPs), cuja atividade é mediada pela perturbação da permeabilidade das membranas celulares dos organismos patogénicos. Uma vez que o desenvolvimento de resistência é pouco provável de ocorrer devido ao seu modo de ação, os AMPs atualmente são considerados bons compostos lead para o desenvolvimento de novos antibióticos. O trabalho de investigação desta dissertação consistiu na síntese e caracterização de um péptido da família dos peptaibols, e de um mimético com potencial atividade antibiótica, assim como a respetiva caracterização conformacional em solução e a avaliação da atividade de permeabilização de membranas modelo por espetroscopia de fluorescência. No final do trabalho pretendia-se dispor de dados conformacionais e de atividade de permeação de membrana suficientes para propor uma relação entre a estrutura (nomeadamente a influência do comprimento e volume das cadeias laterais) e a atividade dos péptidos obtidos ao nível da membrana, tendo em vista a obtenção de péptidos com utilidade farmacológica. O trabalho começou com a síntese do membro mais pequeno dos peptaibols, o pentapéptido Peptaibolin (Ac-Leu-Aib-Leu-Aib-Phol), seguida da preparação de um análogo por substituição dos resíduos de Aib por resíduos de alanina. Após a síntese dos péptidos, por metodologias de síntese em fase sólida assistida por microondas, foi feita a caracterização estrutural através das técnicas espetroscópicas usuais (IV e RMN de 1H e 13C) e por técnicas analíticas como a espetrometria de massa. As preferências conformacionais dos dois péptidos sintetizados e de outros três péptidos em que houve substituição do resíduo de Aib nativo por dialquilglicinas sintéticas de cadeia lateral mais longa ou mais impedida estereoquimicamente (Deg, Dpg e Ac6c), sintetizados no grupo de investigação onde decorreu o trabalho, foram estudadas por espetroscopia de infravermelho (IV) e ressonância magnética nuclear (RMN). Finalmente, foi avaliada a atividade dos péptidos em termos de capacidade de permeação de membrana em membranas modelo com vesículas unilamelares, através de espetroscopia de fluorescência seguindo a libertação da carboxifluoresceína do interior das vesículas.

The resistance to traditional antibiotics has led to the constant search for potential substitutes. One successful area is that of antibiotic peptides (AMPs), whose activity is mediated by disruption of the permeability of cell membranes of pathogens. Since the development of resistance is unlikely to occur due to its mode of action, the AMPs are currently considered good lead compounds for the development of new antibiotics. The aim of the research work of this thesis was the synthesis and characterization of a peptide of the peptaibol family, and a mimetic with potential antibiotic activity, as well as their conformational characterization in solution and evaluation of the activity of permeation of model membranes by fluorescence spectroscopy. By the end of the study, it was intended to gather enough data on conformation and membrane permeation activity to propose a relationship between the structure (namely the influence of the length and volume of side chains) and the membrane activity of the synthesised peptides in order to obtain peptides with pharmacological interest. The work began with the synthesis of the shortest member of peptaibols, the pentapeptide Peptaibolin (Ac-Leu-Aib-Leu-Aib-Phol) followed by preparation of one analogue by substitution of the Aib residues for alanine residues. After peptide synthesis, by microwave assisted solid phase synthesis methodologies, the structural characterization was carried out by the usual spectroscopic methods (IR and 1H and 13C NMR) and analytical techniques such as mass spectrometry. The conformational preferences of the two synthesized peptides and three other peptides in which the native Aib residue was replaced by synthetic dialkylglycines bearing longer or more sterically hindered side chains (Deg, Dpg and Ac6c), synthesized previously by the research group where this work was carried out, were studied by infrared spectroscopy (IR) and nuclear magnetic resonance (NMR). Finally, the activity of the peptides in terms of membrane permeation ability was evaluated with model membranes with unilamellar vesicles by fluorescence spectroscopy by following the release of carboxyfluorescein from within the vesicles.