Study of the mechanisms underlying the cytotoxic effects of bovine lactoferrin on breast cancer cells

Abstract

Lactoferrin (LF) is an iron-binding protein predominantly found in mammalian secretions. This protein and its variants have been proposed for cancer therapy for many years owing to their tumor-targeting properties. Previous studies showed that LF and its derived peptides inhibit the proliferation of cancer cells. However, the detailed mechanisms by which LF exerts its effect are still fairly unknown. Moreover, there are few reports concerning LF effect on breast cancer cells, which is one of the most common malignant tumors in the World. In this sense, the present thesis aimed to investigate the cytotoxicity of bovine lactoferrin (bLF) and its variants against several breast cancer cells, namely T-47D, MDA-MB-231, Hs578T and MCF-7 cell lines. The results showed that bLF at concentrations of 1.875 μM, 3.75 μM, 7.5 μM, 15 μM and 30 μM could efficiently inhibit the growth of cancer cells but showed a very low effect on normal breast cells (MCF-10-2A). Moreover, its variants (apo-bLF, holo-bLF and LfcinB17-41) were also able to inhibit cancer cells’ growth, except for LfcinB26-36. Additionally, bLF, apo-bLF and holo-bLF did not promote the proliferation of breast cancer cells at low concentrations (0.25 μM, 0.5 μM and 1 μM) as reported for other cancer cell lines. Simultaneously, the degradation assay excluded the possibility that bLF anticancer effects could be due to its degraded peptides under cell culture conditions. On the other hand, it was found that most of the bLF was blocked outside the cells, despite that a few amount was able to be internalized to the cytoplasm. Its peptide LfcinB17-41 also succeeded in penetrating the cell membrane but could not enter the nucleus. Subsequently, we found that the inhibitory effects of bLF on the breast cancer cells resulted from the cell cycle arrest without effects in cell death by apoptosis. Depending on the cell lines, this prevention of cell cycle progression induced by bLF occurred at different phases. Nevertheless, the MAPK/ERK and PI3K/AKT signaling pathways were not implicated in the cell cycle arrest observed. bLF anticancer effect was associated, however, with an increase of AMPKα phosphorylation and a decrease in the levels of mTOR and its phosphorylation. To our knowledge this is the first time this pathway has been implicated in the mechanisms underlying bLF cytotoxicity against cancer. These findings suggest that bLF could be a new mTOR-targeting drug in cancer therapy. However, it is important to notice that no apoptotic cells could be found in bLF-treated cancer cells. The use of higher bLF concentrations (12.5 μM, 50 μM, 125 μM and 175 μM) was expected to exhibit different effects on the breast cancer cells as compared with the low concentrations range. In fact, in the high range of concentrations bLF selectively induced cell death by apoptosis in MCF-7 cells. The mechanisms of bLF-induced apoptosis included the intrinsic pathway since it was observed the mitochondrial membrane depolarization and a decrease in Bcl-2 levels. In addition, bLF also induced significantly the cell cycle arrest of these cells at the G1 phase, while the same concentration of another protein source (bovine serum albumin - BSA) did not affected significantly the cells. This suggests that bLF cytotoxicity is not due to the addition of great amounts of exogenous proteins in the cell microenvironment. The western bolt analysis confirmed that bLF blocked the cell cycle progression by adjusting cell cycle related regulators, such as CDC25c. Additionally, bLF showed a clear inhibitory effect on the MCF-7 cells ability to form colonies, which is one of the favorite features of anticancer drugs for preventing metastasis. We also found that the promoting effect on the migration of MCF-7 cells may be due to the fact that bLF changes cell microenvironment positively for cell migration similarly to BSA. The results gathered in this thesis demonstrated the potential of bLF as an anticancer agent and provided some new insights on its mechanisms of action. However, further work is still required before bLF can be considered for clinical applications. Being a food-derived protein, bLF is commonly consumed in the daily life, as well as in supplements for health care. Nevertheless, the relation between its consumption and cancer prevention remains to be elucidated.

A Lactoferrina (LF) é uma proteína com alta afinidade para ligação ao ferro, predominantemente encontrada nas secreções dos mamíferos. Esta proteína e as suas variantes têm vindo a ser propostas como agentes interessantes para a terapia do cancro. Estudos anteriores mostraram que a LF e os seus péptidos inibem a proliferação de células cancerígenas. No entanto, os mecanismos detalhados pelos quais a LF exerce o seu efeito são pouco conhecidos. Além disso, há poucos estudos sobre os efeitos da LF em células de cancro da mama, que constitui um dos tumores malignos mais comuns a nível mundial. Neste sentido, na presente tese pretendeu-se estudar a citotoxicidade da lactoferrina de origem bovina (bLF) e das suas variantes contra várias linhas celulares de cancro da mama, nomeadamente T-47D, MDA-MB-231, Hs578T e MCF-7. Os resultados mostraram que a bLF em concentrações de 1,875 μM , 3,75 μM, 7,5 μM, 15 μM e 30 μM inibe eficientemente o crescimento de células cancerígenas, mas apresenta um efeito muito pouco pronunciado nas células normais da mama (MCF-10-2A). Além disso, as suas variantes (apo-bLF, holo-bLF e LfcinB17-41) também foram capazes de inibir o crescimento das células cancerígenas, exceto o péptido LfcinB26-36. Adicionalmente, a bLF, apo-bLG e holo-bLF não promoveram a proliferação das células cancerígenas a baixas concentrações (0,25 μM , 0,5 μM e 1 μM) tal como foi relatado para outras linhas celulares. Adicionalmente, excluiu-se a possibilidade de que os efeitos anti-cancerígenos da bLF possam ser devidos aos seus péptidos resultantes da degradação da proteína sob as condições de cultura das células. Por outro lado, verificou-se que a maior parte da bLF é bloqueada no exterior das células, apesar de uma pequena quantidade internalizar a célula para o espaço citoplasmático. O péptido LfcinB17-41 também conseguiu penetrar a membrana celular mas não o núcleo. Subsequentemente, verificou-se que os efeitos inibidores da bLF sobre as células cancerígenas da mama resultaram da paragem do ciclo celular, sem se ter observado um efeito na morte celular por apoptose. Dependendo das linhas celulares, esta paragem do ciclo celular induzida pela bLF ocorreu em diferentes fases. No entanto, não foi possível associar as vias de sinalização MAPK/ERK e PI3K/AKT ao efeito observado no ciclo celular. Por outro lado, o efeito anti-cancerígeno da bLF foi associado a um aumento da fosforilação da AMPKα e a uma diminuição dos níveis de mTOR e da sua fosforilação. Esta é a primeira vez que esta via foi associada aos mecanismos subjacentes à citotoxicidade da bLF contra células de cancro. Estes resultados sugerem que a bLF poderá ser uma nova droga, cujo alvo é a proteína mTOR, a explorar na terapia do cancro. No entanto, é importante notar que não se observaram células apoptóticas em nenhuma das linhas celulares tratadas com bLF. Aquando da utilização de concentrações de bLF mais elevadas (12,5 μM, 50 μM, 125 μM e 175 μM) esperava-se que as mesmas exibissem diferentes efeitos sobre as células cancerígenas comparativamente com a gama de baixas concentrações. Na verdade, para concentrações de bLF elevadas observou-se uma indução selectiva de morte celular por apoptose nas células MCF-7. Os mecanismos de apoptose induzida pela bLF incluiram a via intrínseca no sentido em que se detectou a despolarização da membrana mitocondrial e a diminuição dos níveis de Bcl-2. Adicionalmente, a bLF também induziu significativamente a paragem do ciclo celular destas células na fase G1, enquanto que uma concentração similar de outra proteína (albumina do soro bovino - BSA) não afectou significativamente as células. Isto sugere que a citotoxicidade da bLF não é devida ao facto de se adicionarem grandes quantidades de proteína exógena ao microambiente celular. Pela técnica de Western blot confirmou-se que a bLF bloqueia a progressão do ciclo celular, tal como mostrou a diminuição dos níveis da proteína CDC25c. Por outro lado, a bLF mostrou um efeito inibidor evidente sobre a células MCF-7 no que se refere à sua capacidade para formar colónias, o que constitui uma das características desejadas em fármacos anti-cancerígenos para prevenir as metástases. O efeito promotor da bLF sobre a migração de células MCF-7 pode ser devido ao facto desta proteína modificar o microambiente celular de uma forma positiva para a migração celular, tal como se observou com a utilização de BSA. Os resultados obtidos nesta tese demonstraram o potencial da bLF como agente anti-cancerígeno e permitiram esclarecer possíveis mecanismos envolvidos na sua atividade. Todavia, é ainda necessário conduzir mais trabalho de investigação antes que bLF possa ser considerada para aplicações clínicas. Sendo uma proteína derivada de alimentos, a bLF é vulgarmente consumida na alimentação humana, bem como em suplementos para a saúde. No entanto, a relação entre o seu consumo e a prevenção do cancro continua por elucidar.